[发明专利]一种检测立氏立克次体的RPA方法、其专用引物和探针及用途

权利要求书

1.一种用于检测立氏立克次体的RPA专用引物和探针，是根据立氏立克次体特异性保守序列设计的，所述立氏立克次体特异性保守序列如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，

SEQ ID NO.1：

AAGATAATTAATCGCTTATTATTAAAAATTTTCATTTTTTTATTATTTATTACTAGCAATAATCTGTGTTATTTGATAAAATTAAATCTAAAAGAAAGGGAAAGTGTATGAGTAATATTAACGCTAAGTTTTACATACCATTGGTGTCACTACTTGGTGTATTCATTTATTTACTAAATTGTTTTAATAAAATATCTCAGTGTTCTTTAGTATTTGTGTTTTTAGCTATAACTACCAATATTATATCTGAGCTATATGGTAGAAAGAGAGCTTTGATTGCTGTGGCGTTATGTATAATAGTAAGTTTTGGTTTGTTATGGAACTTCAATTATTATATTCATGGTCGTGTTATTAAAGGAGTTGTTTTTGCATCTTTTGTATCTGTATTATTATCAACATATTGTAGTACAAGTATATTTTCACAACTTAAGCCAAGATGTTCTTTGAATACAAGAAATTTTGCTAGTTTAATAATGTGTGCGGTCGTAGATGGTATTGTGATGTCAGGATTTTTTGTAAATGTATTCTCTACAAGTAAAGTTTTGTCGATATTTTATAAAGAAGTATTATATAAATGTGCATATTCATTAACAGTTTATATCTGTATATTTTTAGTTCAAAAAGTATATGGCAATAATGGGAGTGTCCGCGCACTGAAAAATTTTTGAATAAAAAATATAGCTAACCT；

所述引物中的正向引物如SEQ ID NO.2所示的寡核苷酸序列，反向引物如SEQ ID NO.3所示的寡核苷酸序列，且5’端标记生物素（Biotin）,

SEQ ID NO.2：5’ CTAGCAATAATCTGTGTTATTTGATAAAAT 3’，

SEQ ID NO.3：5’ ACAAAAGATGCAAAAACAACTCCTTT 3’，该探针如SEQ ID NO.4所示的寡核苷酸序列，且5’端标记荧光素，3’端添加延伸阻断基团，在第30-31位碱基之间增加一个四氢呋喃（THF）；

SEQ ID NO.4：

5’ TACATACCATTGGTGTCACTACTTGGTGTA[THF]TCATTTATTTACTAA 3’ 。

2.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于：所述探针由荧光素、5’端序列、四氢呋喃（THF）、3’端序列及3’端延伸阻断基团组成。

3.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于：所述的荧光素为羧基荧光素FAM或FITC等其他荧光素，所述的延伸阻断基团为磷酸基团或其他阻断基团。

4.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于：所述探针的长度为45bp，其中5’端30bp，3’端15bp。

5.权利要求1-4中任一项所述的引物和探针在制备立氏立克次体RPA检测试剂中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述应用中用于50μL的RPA反应体系的试剂，所述的正向引物的浓度为10μmol/L，反向引物的浓度为10μmol/L，所述的探针的浓度为5μmol/L、镁离子浓度280μmol/L，模板加样量为1μL；将2.1μL正向引物、2.1μL反向引物、0.6μL探针、1μL样品、12.2μL无DNase 和RNase 水和29.5μL缓冲液组成预混液，加到含有冻干酶粉的0.2mL的TwistAmp nfo反应管中，然后将2.5μL的醋酸镁溶液加到反应管的盖子上；将反应管盖子上的醋酸镁溶液甩下，充分混匀后37℃ 扩增20min，在反应4min，将反应管取出充分混匀，放回反应装置中继续扩增；检测时加样量为5μL，试纸条显色时间控制在3 -5min。