[发明专利]一种藻菌共生系统培养基的优化方法及其培养基

权利要求书

1.一种藻菌共生系统培养基的优化方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1构建藻菌共生体系，确定最优菌藻比例：

S1.1确定藻种和菌种：提供小球藻和赤芝菌株；

S1.2配置驯化BG11培养基：BG11培养基、2％麦芽糖和酵母膏：5.688g/L-6.748g/L，该驯化BG11培养基的配方包括NaNO3：1.703g/L-1.977g/L，K2HPO4：0.047g/L-0.052g/L，pH5；

S1.3培养不同比例的藻菌共生体：将小球藻和驯化好的赤芝菌按照不同比例接入到驯化BG11培养基中进行培养；

S1.4分析比对不同比例的藻菌共生体产出的生物量、总脂、总蛋白含量和脂肪酸种类，筛选出最优菌藻比例；

S2确定培养基中影响藻菌共生体系营养成分产量的主要影响因子：

S2.1确定不同配比的培养基；

S2.2向不同配比的培养基中接入菌藻进行培养，并通过分析藻菌共生体的生物量、总脂含量、总蛋白含量、脂肪酸种类来确定主要影响因子；

S3确定菌藻共生系统的优化培养基：

S3.1根据主要影响因子设计不同配比的培养基，并获得在不同配比培养基下的菌藻共生体的生物量、总脂含量、总蛋白含量；

S3.2建立等高线和响应曲面，确定影响菌藻共生系统生物量的因素交互作用，获得生物量模型方程，并求解得到藻菌共生系统获得生物量的最佳培养基；

S3.3建立等高线和响应曲面，确定影响菌藻共生系统总蛋白含量的因素交互作用，获得总蛋白模型方程，并求解得到藻菌共生系统获得总蛋白的最佳培养基；

S3.4建立等高线和响应曲面，确定影响菌藻共生系统总脂含量的因素交互作用，获得总脂模型方程，并求解得到藻菌共生系统获得总脂的最佳培养基。

2.根据权利要求1所述的藻菌共生系统培养基的优化方法，其特征在于，藻菌共生体培养包括步骤：

S1.3.1小球藻光照培养：将装有小球藻藻液的试管摇匀，在无菌操作下直接转入玻璃三角锥形瓶内，封好瓶口在光照培养箱内培养，培养温度为25℃，光照条件2000Lux，时间设置12Hr昼/12Hr夜；

S1.3.2小球藻扩大培养：取5-10ml藻液加入10-20ml新鲜培养基进行活化，在无菌的三角锥形瓶内培养15天左右，至藻种生长状态好，进行扩大培养，转接比例1:5，培养时每日摇动三角锥形瓶2次；

S1.3.3藻菌共生培养：将足够浓度的小球藻和驯化好的赤芝菌共同在驯化的BG11培养基中培养，并且每天将其放入恒温摇床中培养2h，恒温摇床转速为160r/min，温度为26℃；

S1.3.4藻菌共生光照培养：将其放入光照培养箱内继续培养，观察藻菌球是否能形成以及形成状态。

3.根据权利要求1所述的藻菌共生系统培养基的优化方法，其特征在于，生物量的测定方法：将三角锥形瓶中的藻菌共生体液加入到50mL离心管中，在4000r/min的条件下离心8min—10min，弃上清液，之后用蒸馏水洗涤再离心，重复两次；然后放入80℃干燥箱中烘至恒重后称取干重量，称取三次取平均值，以获得藻菌共生体生物量。

4.根据权利要求1所述的藻菌共生系统培养基的优化方法，其特征在于，总脂的检测方法：取0.1g藻菌共生体干粉研磨后加入无水乙醚和石油醚的混合溶剂，水浴超声振荡10min，在20℃环境下抽提4h，抽提结束后加入质量分数为10％NaOH沉淀细胞，然后在4000r/min的条件下离心15min取上层清液，再放入60℃水浴锅中迅速蒸去多余的溶剂至溶液恒重；在蒸去多余的溶剂的溶液中加入等体积的饱和NaOH-甲醇溶液皂化过夜，置于4℃冷藏室中进行；然后用HCl稀溶液调节pH值至1-2，再加入少量去离子水离心分离取上层油层；最后放入在40℃烘箱中蒸去多余的溶剂至油液恒重，以获得藻菌共生体总脂。

5.根据权利要求1所述的藻菌共生系统培养基的优化方法，其特征在于，总蛋白含量的测定方法：取剩余藻菌共生体干粉研磨加入4mL 0.15mol/L NaCl，水浴超声10min，在8000r/min的条件下离心10min取上层清液；取1mL藻菌可溶性蛋白液加入5mL考马斯亮蓝试剂混匀，在25℃下保温10min，静置5min，于波长595nm下测定其吸光度值。

6.根据权利要求1所述的藻菌共生系统培养基的优化方法，其特征在于，脂肪酸种类的检测方法：采用毛细管气相色谱-质谱联用法，色谱条件：100m×0.25mm×0.20um毛细管柱，载气为氦气，流速为0.5mL·min＾-1,压力280kPa；喷嘴和检测器都设为260℃，分流比为30:1，进样量1μL，升温程序为柱温140℃，保持5min，以4℃·min＾-1升至240℃，保持 20min。