[发明专利]鉴别鲜冬虫夏草的特征蛋白质组合及发现方法和应用

权利要求书

1.一种发现鉴别鲜冬虫夏草的特征蛋白质组合的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)制备冬虫夏草供试品溶液；

(2)使用LC-MS技术测定供试品溶液得到蛋白质特征图谱，其中，

高效液相色谱条件：所用的色谱柱为反相色谱柱，所述的反相色谱柱的填充剂为四烷基硅烷键合硅胶；流动相A为0.1％甲酸-水，流动相B为0.1％甲酸-乙腈；

梯度洗脱条件：

0min→22min：20％B→31％B；

22min→23min：31％B→90％B；

23min→28min：90％B→90％B；

质谱条件：离子源：Dual-ESI；离子化模式：正离子；扫描模式：SIM；干燥气温度：350℃；干燥气流速：10L/min；雾化器压力：50psi；毛细管电压：3500V；筛选离子时间及质荷比：

通道1：

A1：0-12.5min筛选离子包括870.8，922.1，979.7，1045，1119.5，1205.5；

A2：12.5-15min筛选离子包括958.5，1026.8，1105.7，1147.1，1197.8，1306.7，1596.8；

A3：15-18min筛选离子包括817.0，871.4，933.4，1005.2，1088.9，1187.7；

A4：18-24min筛选离子包括981.7，1015.5，1051.6，1090.4，1132.3，1177.7，1226.6，1280，1338；

通道2：

A5：0-15min筛选离子包括969.4，1038.5，1118.2，1211.4，1321.1，1453.4，1596.6；

A6：15-24min筛选离子包括821.3，876.1，938.6，1010.7，1094.8，1194.3。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述特征蛋白质组合选自A1和A2的组合，A1和A3的组合，A1和A4的组合，A2和A3的组合，A2和A4的组合，A3和A4的组合，A1、A2和A3的组合，A1、A2和A4的组合，A2、A3和A4的组合，A1、A3和A4的组合，A1、A2、A3和A4的组合，或A5和A6的组合。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述反相色谱柱规格为Sepax bio-C44.6mm×150mm，3μm，检测波长：214nm；流速：0.6mL/min；柱温：30℃；所述反相色谱柱的填充剂为四烷基硅烷键合硅胶。

4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述冬虫夏草供试品溶液制备方法包括：

a、称取冬虫夏草样品，按照重量体积比1:7～10g/mL加入超纯水，匀浆，匀浆温度控制为5-10℃；

b、将匀浆至无明显颗粒的样品取出，超声提取，温度控制为15-20℃，然后将超声提取后的样品放入-20-4℃冰箱中冷冻；

c、将冷冻后的样品取出，解冻后再次匀浆，超声提取，提取温度控制为15-20℃；离心，离心温度控制为4-10℃，得上清液，冻干；

d、往冻干样品中按照重量体积比1:10-15g/mL加入超纯水，复溶，之后按照体积比为1:4-8加入无水乙醇，搅拌均匀后放置4-10℃下静置过夜；随后离心，离心温度控制为4-10℃，收集絮状沉淀，并往沉淀中按照重量体积比1:10-15g/mL加入超纯水使之复溶；最后使用水系滤膜过滤，即得供试品样品。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)和(c)超声提取的提取时间为30-40min，超声功率为400-600W，温度控制为15-20℃。