[发明专利]用于内源性过表达lncRNA-XIST的gRNA靶点序列及其应用

说明书

本发明公开了一种用于内源性过表达lncRNA‑XIST的gRNA靶点序列、CRISPR/dCas9慢病毒系统及其应用。所述的gRNA靶点序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示。所述的CRISPR/dCas9慢病毒系统包含所述的用于内源性过表达lncRNA‑XIST的gRNA靶点序列。本发明利用慢病毒必须整合到宿主基因组的特性来筛选稳定株的方法，配合CRISPR/dCas9实现对大片段基因lncRNA‑XIST的内源过表达，克服了传统方法无法稳定表达大片段基因lncRNA‑XIST的弊端，可以在短时间内获得高效率的大片段基因lncRNA‑XIST过表达稳定细胞株，筛选得到的细胞或者可稳定表达目的基因，从而得到稳定沉默lncRNA‑XIST下游特定基因的细胞株，对于lncRNA‑XIST在滋养细胞迁移中的功能和在增殖障碍、胎儿生长受限发生中的作用的研究具有重要指导意义。

技术领域

本发明具体涉及一种用于内源性过表达lncRNA-XIST的gRNA靶点序列、CRISPR/dCas9慢病毒系统及其应用。

背景技术

胎儿生长受限(fetal growth restriction,FGR)是产科的严重并发症，其发生率为5-10％，是导致围生儿死亡的主要原因之一，可导致围生儿患病率增高4-6倍。FGR不但影响胎儿的生长发育，还会导致青少年期的体格和智力发育受损，甚至可发生脑性瘫痪，成年后心血管、神经系统和代偿性疾病患病率升高。因此，需要深入研究FGR发生的分子机制，以便为胎儿生长受限早期干预和早期防治提供理论依据和潜在干预靶标。很多因素可造成胎儿生长受限，包括母体、胎儿、胎盘和环境因素，因此发病机制的研究一直是产科领域的研究热点。虽然很多研究者长期致力于FGR发病机制的研究，提出胎盘发育异常，母体感染，遗传因素等导致胎儿生长受限，但是引起FGR确切机制尚不清楚。近年来研究发现胎盘滋养细胞迁移和增殖障碍，影响胎盘的大小、形态和营养转动能力，进而影响胎儿生长的营养供应，导致胎盘物质转运能力减弱，交换表面积减少，胎儿营养供应减少，最终引起FGR的发生。目前有研究提示胎盘滋养细胞迁移和增殖障碍受到一些表观遗传调控和非编码RNA(ncRNA)调控因子的调控。

非编码RNA(ncRNA)是指不编码蛋白质但在生物体生命活动中具有功能的RNA分子，根据其长度分为小于200nt的短链非编码RNA和大于200nt的长链非编码RNA(lncRNA)。短链非编码RNA包括微小核糖核酸(miRNA)和小干扰RNA等，miRNA是一类大小约18-25个核苷酸的非编码RNA，通过与靶mRNA 3’非翻译区(UTR)的碱基配对来调控基因的表达，导致靶mRNA的降解或者翻译抑制影响蛋白表达，参与多种生理和病理过程。目前国内外研究表明非编码RNA(ncRNA)在基因调控因子介导细胞的增殖、迁移、分化、周期、凋亡等生物过程，对正常生长发育、生理功能以及多种肿瘤、先天性和神经系统等疾病的发生发展中起关键作用。近年研究表明，miRNAs在胎盘的正常发育中发挥重要的调节，异常表达与胎盘疾病相关，如巨大儿、子痫前期、胎儿生长受限、早产等。

本案发明人在前期研究中发现miR-424和miR141在胎儿生长受限的胎盘组织中高表达，并且其靶基因的FGFR1、MEK1、PLAG1mRNA和蛋白表达水平下降。但是否还有其它非编码基因影响胎盘发育及功能发挥，继而导致胎儿生长受限的发生仍不清楚。

外源基因在细胞中的表达可分为两大类，一类是瞬时表达，一类是稳定表达(永久表达)。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，虽然可以达到高水平的表达，但通常只持续几天。后者外源DNA整合到宿主细胞染色体上，使宿主细胞可长期表达目的基因。建立稳定细胞株，一般是根据不同基因载体中所含有的抗性标志选用相应的药物对靶细胞进行筛选。最常用的抗性标记基因有潮霉素(hygromycin)、新霉素(neomycin)和嘌呤霉素(puromycin)，常用Hygromycin B、G418和puromycin进行选择性筛选。传统的稳定株筛选方法需要通过外源基因的瞬时转染后对靶细胞进行筛选，最终获得从单一细胞扩增起来的稳定细胞株，该方法阳性率低，周期长，工作量大。