[发明专利]用于预测肝癌发生风险的试剂盒及方法

说明书

本发明涉及一种用于预测肝癌发生风险的试剂盒及方法，涉及医学体外诊断技术领域，具体地说是通过SCT、NFIX、IGF2、ABCG5、GSTO2、SARDH、E2F6、SHANK2、GATA4、OPLAH、NR2F1和ZFHX3中单基因或多基因的CpG岛甲基化状态对肝癌发生的风险进行预测的试剂盒及方法。本发明多个基因的联合甲基化检测，灵敏度得到极大提高；对唾液、尿液、血液等的游离核酸进行检测，无需从癌组织中取材，检测无创，且操作简便。

技术领域

本发明涉及医学体外诊断技术领域，具体地说是通过SCT、NFIX、IGF2、ABCG5、GSTO2、SARDH、E2F6、SHANK2、GATA4、OPLAH、NR2F1和ZFHX3中单基因或多基因的CpG岛甲基化状态对肝癌发生的风险进行预测的试剂盒及方法。

背景技术

肝癌是全世界第四常见的肿瘤。在中国，肝癌是仅次于肺癌、胃癌的诊断数量，居第三位的肿瘤，2015年肝癌的发病人数为46.6万人，因肝癌死亡人数在42.2万。高发病率和高死亡率是由于肝癌早期症状不明显，肝癌的预测和早期诊断很困难，通常在晚期才能得到确诊，此时往往已经发生了肿瘤细胞的转移，治疗难度高，患者的生存状况很难得到改善。

因此肝癌的早期发现对于治疗有重要意义，是肝癌患者获得长期生存和提高生存质量的重要途径。现有的早期筛查和诊断的方法有肿瘤标志物甲胎蛋白(AFP)检测和超声、常规CT扫描等影像学检查。然而单独用AFP检测灵敏度不高，约1/3的肝癌患者会因此而漏诊。而超声和CT扫描对于早期肿瘤组织较小的筛查也有灵敏度不高的特点，CT扫描肝脏占位直径大于1cm才能诊断为肝癌。无论是单独用AFP还是联合影像学检查，其在肝癌的预测和早期诊断中效果均不是太好。

随着分子生物学的发展，近年来在肝癌组织中，已经发现了大量与肝癌早期筛查、预后判断和复发预测相关的分子标志物，如基因突变、基因表达、基因甲基化和非编码RNA等。

其中，研究发现了基因甲基化可作为肝癌的早期筛查、患者分层和预后判断、提示复发的重要的生物标志物。如抑癌基因P16/CDKN2A、谷胱甘肽S转移酶P1(GSTP1)基因、BSAP1、SRD5A2、RASSF1等。通过对肝癌发生高危人群和肝癌患者(主要是早期患者)的手术组织中这些基因的甲基化状态和甲基化水平进行检测，可以对肝癌进行筛查、预后判断和复发预测，多基因联合的甲基化检测的灵敏度比AFP及影像学检查要高。

然而，目前检测肝癌患者基因甲基化的标志物主要通过检测肝癌组织，由于肝癌组织在早期筛查中不易获取，主要来源于肝硬化等手术组织，大大缩小了其应用范围，且该筛查基本只能检测一次，难以在一段时间内连续获取标本和检测，因此无法监测病程的进展情况。

同时，由于肿瘤的异质性，组织中不同部位的甲基化水平可能会有所差异，因此手术组织的获取水平以及组织差异，可能会影响检测结果，导致检测结果的假阴性。

DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰，其中最常见，研究最为清晰的是CpG位点中胞嘧啶第5位C原子的甲基化(5mC)，简而言之，就是在DNA甲基转移酶和S-腺苷甲硫氨酸的作用下，DNA序列中的胞嘧啶被转化为5-甲基胞嘧啶。

DNA甲基化的主要位点是CpG岛，其甲基化状态对基因表达起着重要的调控作用。CpG岛是基因组DNA中CpG位点富集的区域，一般认为，CpG岛具有以下特点：1)长度大于200bp；2)GC含量大于50％；3)该段序列中，[CpG位点数*该段序列长度/(C碱基的个数*G碱基个数)]*100％＞60％。CpG岛所在的区域一般为转录起始位点上下游一段区域，大小在200-3000bp之间，最常见的区域为转录起始位点上下游，此外在基因间和基因内也会有CpG岛。

据统计，人类基因组中70％基因的启动子区域含有CpG岛。CpG岛中的CpG位点经常会发生甲基化，多位点的甲基化往往导致基因的表达沉默，这些基因的沉默又与人类生长发育、DNA错配修复等信号通路相关。