[发明专利]基于毛细管电泳荧光SSR指纹图谱鉴别刺槐品种的方法

说明书

本发明公开了一种基于毛细管电泳荧光SSR指纹图谱鉴别刺槐品种的方法，构建方法步骤包括：(1)刺槐总DNA提取，(2)利用SSR引物进行PCR扩增，(3)PCR扩增产物毛细管电泳，(4)指纹图谱构建；其中：步骤(2)利用公开的四对SSR引物进行刺槐DNA的PCR扩增，所得产物经毛细管电泳检测所得的带型结果，组合形成每个品种或者无性系的SSR指纹图谱，根据指纹图谱的差异，再区分无性系。本发明可以快速、准确、高效的从分子水平为刺槐品种鉴定、新品种选育和遗传改良提供可靠的依据，为中国刺槐遗传资源保存、评价与利用提供参考。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种基于毛细管电泳荧光SSR指纹图谱鉴别刺槐品种的方法。

背景技术

刺槐(Robinia pseudoacacia L.)为豆科(Leguminosae)刺槐属(Robinia)阔叶乔木，耐干旱、耐瘠薄、耐轻度盐碱、抗污染能力强、自然更新能力强，是荒山造林和水土保持先锋树种，且具有观赏、材用、蜜源和饲用价值。刺槐作为外来物种，在我国已经栽培了近120年，中国各地区栽培的刺槐无性系来源记载不清，遗传关系不明，遗传多样性状况信息甚少，同物异名现象时有发生，急需系统开展刺槐无性系遗传多样性分析和指纹图谱构建，对于下一步开展新品种选育、遗传改良和品种鉴定具有重要意义。

传统的刺槐品种鉴定主要依靠营养器官和生殖器官的形态性状差异，受环境和生长阶段的影响很大，该方法无法有效的在幼树早期进行应用，并且对于表型性状相似或亲缘关系很近的品种，极易出现无意识的混种、混系、混株现象，或者有意识的侵权现象，给生产、科研和植物新品种保护等工作带来极大的不方便，所以利用SSR标记从分子水平进行品种鉴定稳定性高、重复性好、更有说服力，而且能够鉴定所检测位点是纯合还是杂合的。为此，给特定品种或无性系构建指纹图谱成为非常必要和紧迫的任务，对解决我国刺槐品种间的鉴定问题与良种早期选育等具有重要的意义。

目前在木本植物的遗传学分析中，应用较多的主要是RAPD，ISSR，AFLP等分子标记，但是这些标记大多是采用无全基因组序列信息的技术开发得到，荧光SSR是根据SSRs两端的高度保守序列设计引物，进而合成荧光引物，进行PCR扩增，然后用毛细管电泳仪对产物进行毛细管电泳，根据不同的峰值检测多态性并构建指纹图谱，此种方法比聚丙烯酰胺凝胶电泳法更易于实现自动化读值，实现规模化检测，且准确可靠。

到目前为止国内外仅有少量关于刺槐SSR分子标记开发及利用的研究报道，Lian等(2004)利用SSR引物研究了刺槐的一个突变位点Rops15，该位点表现出超突变性，其在刺槐无性系内、无性系之间和子代的突变率分别是6.27％、6.11％和3.78％；谷俊涛(2006)利用6对基因组SSR引物采用聚丙烯酰胺电泳分析了19个刺槐群体608个刺槐个体的遗传结构和遗传多样性；同年方志达(2006)采用聚丙烯酰胺电泳利用SSR标记成功鉴别形态上不易区分的红花刺槐(Robinia pseudoacacia var.decaisneana)和香花槐；Kentaro等(2008)开发了23对基因组引物，并利用日本东北部一个39个样本的群体和一个无性系研究了这些位点的特性，11对具有很高的多态性；袁存权等(2010)利用SSR标记技术进行了航天诱变刺槐群体遗传多样性分析，未检测到基因组的广泛变异；赵克奇等(2014)采用聚丙烯酰胺电泳进行了刺槐EST-SSR标记PCR反应体系的优化。尚未见这些SSR标记应用于刺槐指纹图谱构建。

发明内容

基于上述现有技术，本发明的目的之一在于提供一种基于毛细管电泳荧光SSR指纹图谱的构建方法。

为了实现上述目的，提供了以下技术方案：

一种基于毛细管电泳荧光SSR指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：

(1)刺槐总DNA提取(优选的：采用植物组织基因组DNA提取试剂盒(磁珠法)提取刺槐总DNA)；