[发明专利]检测电子烟气溶胶水提物对细胞超氧化物歧化酶活性影响的方法

说明书

技术领域

本发明属于烟草及烟草制品的安全性生物学评价技术领域，具体是涉及一种检测电子烟气溶胶水提物对细胞超氧化物歧化酶活性影响的方法。

背景技术

随着人们对健康的关注越来越高，对烟草产品提出了更高的要求，不但要有较好的口感，而且要尽可能的减少人体的不良感受。电子烟制品避免了传统卷烟制品燃烧所产生的复杂混合物所带来的危害，现阶段已成为国外烟草公司从传统卷烟制品转向的新方向之一。电子烟制品其使用过程中通过电加热或者电子雾化方式使由烟碱、香味物质等组成的液体转化为类似于卷烟烟雾的混合物，再将雾化后的丙三醇/尼古丁等混合“烟雾”传送至消费者，使人吸入剂量不等的尼古丁而获得类似于抽吸传统卷烟的生理感受。电子烟研发人员在烟液产品配方设计初期，将不同组份按照不同比例组合调配，形成具有不同风格的初选配方，再结合化学评价和感官评价对配方进行不断筛选调整，形成最终的产品配方。但初选配方数量众多，全部进行感官评价耗时耗力，且感官评价侧重于对产品的风格口感进行筛选，如何利用生物学测试技术对产品初选配方进筛选，以获得降低人体不良感受的产品配方，目前尚属探索阶段，并无统一的标准方法。

人的机体在遭受各种不利刺激时，体内高活性分子如活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)产生过多，当氧化程度超出氧化物的清除，氧化系统和抗氧化系统失衡，从而导致组织的氧化性损伤。超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase简称SOD)是生物体内重要的抗氧化酶，是生物体内清除自由基的首要物质，它可以把有害的超氧自由基转化为过氧化氢。尽管过氧化氢仍是对机体有害的活性氧自由基，但体内的过氧化氢酶(CAT)会将其分解为完全无害的水，因此，超氧化物歧化酶活性的高低直接影响到自由基的有效清除，对其进行测定，可用于产品初选配方的进一步筛选，以获得降低人体不良感受的产品配方。

同时，电子烟烟液经雾化后进入口腔和呼吸道，经由唾液及呼吸道粘液迁移作用于机体。而现有技术通常是直接对电子烟液本身进行分析测试，未考虑其抽吸时的形态、迁移等过程，导致分析测试的结果出现误差，不能准确反应电子烟烟液对细胞超氧化物歧化酶酶活力的真实影响。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种检测电子烟气溶胶水提物对细胞超氧化物歧化酶活性影响的方法，为准确评价电子烟制品对细胞的氧化性损伤影响提供技术支持。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现。

除非另有说明，本发明所采用的百分数均为体积百分数。

一种检测电子烟气溶胶水提物对细胞超氧化物歧化酶活性影响的方法，具体为以下步骤：

(1)样品前处理：

采用直线型吸烟机，在抽吸容量为55.0ml，持续时间3s，抽吸频率30s的条件下，连续抽吸100口电子烟，用装有FM细胞培养基的捕集瓶捕集电子烟烟雾，捕集浓度为20口/mL，捕集液用0.22μm无菌过滤器过滤除菌，得到电子烟烟雾的气溶胶水提物作为待测液，-80℃保存待用；

(2)单细胞悬浮液的制备：

人肺成纤维细胞HPF复苏后，接种到25cm²细胞培养瓶中,加入10mL FM细胞培养基，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，倒置显微镜观察培养细胞的汇合和形态情况，待细胞长至70％～90％的汇合率时，移除培养瓶中的FM细胞培养基，用磷酸缓冲液洗两次，弃洗液；加入1mL 0.25％(w/v)的胰蛋白酶溶液单层孵育1～2min，用FM细胞培养基悬起，形成单细胞悬浮液；

(3)单细胞悬浮液的细胞浓度计算：

用血球计数板计数法对所得单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，得到每毫升单细胞悬浮液的活细胞数；

(4)细胞接种：

将计数后的单细胞悬浮液用FM细胞培养基稀释至2.0×10⁵个/mL，接种到100mm细胞培养皿中，每皿6ml，然后将细胞培养皿置于37℃、5％CO₂培养箱内培养24h；

(5)受试物暴露

取出细胞培养皿，去除细胞培养液，按照表1将不同剂量的待测液加入细胞培养皿中，每个剂量设3个复孔，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养24h；

表1 细胞超氧化物歧化酶活性检测加样表

(6)收集细胞：