[发明专利]一组特异识别三种海洋毒素的核酸适配体

说明书

本发明提供了一组能同时识别软骨藻酸和河豚毒素的单链DNA核酸适配体DA‑01和TTX‑27，一条能特异性识别软骨藻酸的单链DNA核酸适配体DA‑06，一条能特异性识别河豚毒素的单链DNA核酸适配体TTX‑07，一条能特异性识别石房蛤毒素的单链DNA核酸适配体STX‑41。本发明采用磁性还原氧化石墨烯(MRGO)辅助分离的指数富集配体系统进化(SELEX)技术，利用磁性还原氧化石墨烯能吸附游离的单链DNA但不能吸附与靶标分子结合的单链DNA的特性，同时利用其磁分离富集特性，将对靶标毒素具有亲和性的和无亲和性的单链DNA分离，经过16轮反复的孵育、分离、扩增、制备单链的体外筛选，对所得ssDNA进行一级结构同源性和二级结构相似性分析，然后测定其亲和性和特异性，最终获得一组高亲和性和特异性的核酸适配体。该组适配体在水产品中软骨藻酸、河豚毒素、石房蛤毒素的分析检测和分离富集脱除净化方面具有广泛的应用前景。

技术领域

本发明属于食品安全生物技术领域，涉及利用磁性还原氧化石墨烯辅助分离的指数富集配体系统进化技术筛选一组能同时识别软骨藻酸和河豚毒素的单链DNA核酸适配体及能特异性识别软骨藻酸、河豚毒素、石房蛤毒素的单链DNA核酸适配体各一条。

背景技术

海洋毒素主要来自有毒藻类，经食物链传递给水生动物并在其体内积累。近年来，随着海洋赤潮和湖泊蓝藻爆发的加剧，人们因食用含毒水产品造成的食物中毒事件逐渐增多。海洋毒素种类繁多，根据其溶解性不同可以分为亲水性和亲脂性两大类。石房蛤毒素(Saxitoxin,STX)、软骨藻酸(Domoic acid,DA)和河豚毒素(Tetrodotoxin,TTX)是最主要的三类亲水性海洋毒素。STX和TTX都是钠离子通道抑制剂，能通过选择性地结合电压门控钠离子通道表面受体阻止钠离子的传输，进而阻断神经冲动的传导，从而引起神经麻痹、呼吸困难等症状，甚至造成死亡。软骨藻酸是一种类氨基酸的兴奋性神经毒素，与中枢神经系统中的丙酸受体、谷氨酸受体、天冬氨酸受体都具有很强的亲和力，通过激活这些受体引起Ca²⁺、Na⁺在神经细胞中的过量积累并产生活性氧，进而对神经系统造成损害，表现出失忆、方向感迷失、癫痫、昏迷等症状。这些毒素不仅会对人们的健康和安全造成危害，也会影响水产品行业，破坏生态环境。因此，快速、准确地检测水产品或水体中的毒素显得尤为重要。

小鼠生物测试法是应用最广泛的海洋毒素检测方法，也是很多国家的法定检测方法，可以通过症状观察和致死率计算进行直观的毒性分析。然而，这种方法分析周期较长，重复性很差，且无法区分不同的毒素并对其精确定量，其最大的缺陷还在于实验伦理问题。鉴于此，欧盟、日本、中国等都开始采用依赖于仪器的化学分析法代替小鼠生物法作为毒素的标准检测方法。化学分析法主要采用气相色谱、液相色谱、毛细管电泳结合荧光法、质谱法等对各类毒素进行分辨和定量。这类方法一直是人们研究的热点，已衍生出了众多新型的方法，精确度非常高，且可进行多组分同时检测和高通量分析。但是，化学分析法也具有仪器设备昂贵，需要专业操作分析人员，样品前处理复杂等缺点，并且也不适应目前越来越重要的现场快速检测。免疫检测法是基于抗原-抗体的特异性识别，结合比色、荧光、化学发光、电化学、石英晶体微天平、表面等离子共振等技术构建的新型快速检测技术。免疫法操作简便，基于酶联免疫吸附法已开发出了众多商品化的试剂盒，而胶体金试纸条更是适用于现场检测。但是，抗体的制备复杂、耗时，特别是对于小分子的海洋毒素，其免疫原性较低甚至无免疫原性，而其毒性却对实验动物和细胞有害。制备得到的抗体不易长期保存，交叉反应也是其难以避免的缺点。