[发明专利]一种血清中提取外泌体的方法及试剂

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体属于一种分离血清外泌体的方法以及试剂。

背景技术

外泌体是直径为30-150nm的小囊泡，是由活细胞选择性包装并释放。在人体的体液中，如血液、尿液以及脑脊液等，含量丰富。外泌体内含有不同种类的脂质、核酸以及蛋白等，这些物质可以被运输到特定的靶细胞，从而发挥相应的生物学功能。因此，外泌体在细胞间通讯以及生理和病理过程中发挥着巨大的作用。

近年来外泌体在疾病研究领域的应用已广泛开展。而血清作为临床诊断常用的样本来源，又因其外泌体含量丰富，因而血清外泌体的在临床应用方面的研究已经在深入开展。据报道，原发性硬化性胆管炎、胆管癌以及肝癌之中尚未发现有明显的标志物可以来区分不同的疾病，而Ander Arbelaiz等人的研究表明(Ander Arbelaiz et al，Hepatology，doi:10.1002/hep.29291，2017)，原发性硬化性胆管炎、胆管癌以及肝癌患者的血清外泌体，在蛋白质组方面之间存在有明显的差异，这提示血清外泌体可为后续临床的诊断提供一定的基础。Hong-Ling Jia等人的研究(Hong-Ling Jia et al,Sci.Rep.7,44706；doi:10.1038/srep44706,2017)则发现miRNAs可以作为诊断川崎病的候选分子标志物。

目前，血清外泌体最常用的提取方法主要有三种，其一是超高速离心法，其二是，免疫磁珠法，其三是试剂盒法，如美国的Thermo公司以及SBI公司提供的相关的血清外泌体的制备试剂。但三者都有明显的不足之处，超高速离心法，所获得的外泌体纯度高，但是得率低；免疫磁珠法，能够特异性的捕捉到相应的外泌体，但是该项技术仅为少数国际巨头公司所掌握，如美国SBI公司等，导致成本高昂；试剂盒法提取，众所周知，外泌体的得率高，但是其共同点是外泌体的纯度太低，在获取外泌体的同时，也会得到许多血清中高丰度的蛋白质。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种用于提取血清外泌体的试剂。

本发明所提供的试剂为聚乙二醇溶液以及凝聚胺溶液。

优选的，在于聚乙二醇溶液与凝聚胺溶液的联合使用，聚乙二醇溶液的工作浓度为50-250mg/mL，凝聚胺溶液的工作浓度为0.005-0.2mg/mL。

优选的，在于聚乙二醇溶液为聚乙二醇的水溶液，聚乙二醇的分子量为6000-10000道尔顿。

优选的，在于凝聚胺溶液为凝聚胺的盐溶液。

本发明试剂的使用方法，具体步骤如下：

优选的，在于将血清样本置于室温水浴解冻后，4℃，3000g，离心10分钟，留取上清。

优选的，在于向上清中加入1/5体积的500mg/mL的聚乙二醇10000的水溶液，混匀。

优选的，在于向上述混合液中加入1/10体积(上清体积)的凝聚胺的盐溶液，混匀。

将上述混合液，4℃，静置，30分钟。

将静置后的混合液，4℃，5000g，离心10分钟。

所得沉淀即为外泌体。

本发明的试剂不仅可以显著提高外泌体的得率，同时能够显著减少血清中的高丰度蛋白。本方法得到的外泌体与Thermo试剂盒相比，RNA的得率更高，同时，在对外泌体标志性蛋白进行检测时，目标蛋白的丰度更高，其他血清杂蛋白的丰度也显著较少。本发明提供的外泌体制备试剂，操作简单，成本低，得率高，同时可以保证较高的纯度，不需要另外购买一些去除血清高丰度蛋白的试剂盒，降低实验成本。

附图说明

图1为单独使用聚乙二醇溶液与本发明试剂提取外泌体的相关标志物检测结果比较。TSG101和CD63为人类的外泌体表面标志性蛋白分子，泳道1-4位单独使用聚乙二醇溶液，5-8为使用本发明试剂。

图2为不同来源的血清样本外泌体抽提后，外泌体标志物CD63，CD9以及TSG101检测的结果以及透射电镜的检测结果。

图3为与Thermo试剂盒法对比所得血清外泌体中RNA的含量。

图4为与Thermo试剂盒法比较检测血清外泌体标志物的情况以及杂蛋白检测的情况。

具体实施方式

下述实施例中所用的材料、试剂，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、血清外泌体的大小分布以及数量测定

取混合好的血清样本2mL，4℃，3000g，离心10分钟，留取上清。