[发明专利]亨利兜兰EST-SSR标记引物、其开发方法及其应用

说明书

本发明公开了一组基于亨利兜兰转录组序列开发的EST‑SSR标记引物组，包括34对引物，所述引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.68所示。本发明还公开了包含本发明所述的亨利兜兰EST‑SSR标记引物的试剂。本发明进一步公开了一种开发亨利兜兰EST‑SSR标记引物的方法。本发明提供的亨利兜兰EST‑SSR标记引物具有诸多优势，例如多态性丰富、可重复性好、扩增稳定以及便于统计等，可用于亨利兜兰和兜兰属尤其是兜兰亚属其它种的种质资源遗传多样性分析、分子标记辅助育种以及兜兰属植物相关的分子研究。

技术领域

本发明涉及基于亨利兜兰(Paphiopedilum henryanum)转录组序列开发的EST-SSR标记引物、其开发方法及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

亨利兜兰属于兰科(Orchidaceae)兜兰属(Paphiopedilum)植物，原产我国广西西南部、云南东南部及越南北部，生长于海拔900-1300m的石灰岩地区隐蔽缝隙中或常绿阔叶林和灌木林中多石或排水良好之地。现所有兜兰属植物均被列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》附录一名录而被禁止贸易。兜兰作为一种濒危物种，其遗传多样性的研究变得十分重要，兜兰的保育工作更加刻不容缓。

简单重复序列(Simple sequence repeat，SSR)标记因具有多态性高，重复性好，特异性强，检测方便，共显性，标记覆盖整个基因组且均匀分布等特点，已成为遗传多样性分析中很重要的一种遗传标记之一(Phuekvilai，Prattana&Pongtongkam，Pradit&Peyachoknagul，Surin“Development of Microsatellite Markers for Vanda Orchid，”Kasetsart Journal-Natural Science，2009，43(3)：497-506；Kalia R K，Rai M K，KaliaS等，“Microsatellite markers：an overview of the recent progress in plants，”Euphytica，2011，177(3)：309-334)。与基因组SSR标记相比，EST-SSR来源于表达基因组区域，可为功能基因提供“绝对”的标记，开发成本低，物种间通用性较高(朱振东，贾继增，“小麦SSR标记的发展及应用”，《遗传》，2003，(03)：355-360；Varshney，R.K.等，“Interspecific transferability and comparative mapping of barley EST-SSRmarkers in wheat，rye and rice，”Plant Science，2005.168(1)：第195-202页)。近年来测序技术不断发展，转录组测序技术(RNA-seq)为发现新转录本和基因表达丰度及SSR位点的发掘提供了机遇(Zhang H，Wei L，Miao H，等，“Development and validation ofgenic-SSR markers in sesame by RNA-seq，”BMC Genomics，2012，13(1)：316-316；Noakes A G，Best T，Staton M等，“Cross amplification of 15EST-SSR markers in thegenus Fraxinus，”Conservation Genetics Resources，2014，6(4)：969-970；Adal AM，Demissie Z A，Mahmoud S S等，“Identification，validation and cross-speciestransferability of novel Lavandula EST-SSRs，”Planta，2015，241(4)：987-1004)，对于非模式生物或者是无全基因组测序的生物，利用转录组测序开发具有基因信息的SSR标记来分析生物的遗传多样性也是一种简单高效的研究方法，该方法在兰花中也多次报道(Tsai CC，Shih HC，Wang HV，Lin YS，Chang CH等，“RNA-Seq SSRs of Moth Orchid andScreening for Molecular Markers across Genus Phalaenopsis(Orchidaceae)，”PLOSONE，2015，10(11)：e0141761)。然而迄今为止，兜兰属植物EST-SSR标记的研究尚未见报道。