[发明专利]一种小鼠胰腺内浸润的免疫细胞分离方法

说明书

技术领域

本申请涉及一种组织内细胞分离方法，特别是一种小鼠胰腺内浸润的免疫细胞分离方法。

背景技术

胰腺作为人体中最重要的器官之一，其生理作用和病理变化都与生命息息相关。近年来，随着人们生活质量的提高，人们的饮食结构也发生着变化，从而也出现了越来越多的胰腺疾病。目前在我国乃至世界范围内胰腺疾病的发病率均有上升的趋势。有关胰腺的疾病，诸如急慢性胰腺炎、特发性胰腺炎、自身免疫性胰腺炎、胰腺癌等的报道越来越多，胰腺疾病逐渐被引起重视。很多研究学者对胰腺的研究多集中在对胰腺癌相关信号转导通路研究、对胰腺癌发病分子机制研究、对胰腺癌的分子遗传学研究等。因此分离胰腺内浸润的免疫细胞成为多种研究的重要基础工作。但目前没有系统的胰腺内浸润免疫细胞的分离方法，已有其他组织器官内细胞的分离方法则耗时长、得率低、步骤复杂，并且无法用于胰腺内细胞的分离。

发明内容

针对现有分离方法耗时长、得率低、步骤复杂且无法用于胰腺内浸润免疫细胞的缺陷，本发明提供一套简化、高效、稳定的小鼠胰腺内浸润的免疫细胞分离方法。具体的，本发明的小鼠胰腺内浸润的免疫细胞分离方法，包括如下步骤：

(1)胰腺组织块的准备：处死小鼠，取出胰腺，置于4℃装有磷酸盐缓冲溶液的3.5cm直径放置于冰上的培养皿，用磷酸盐缓冲溶液清洗1-2次，移至新的3.5cm培养皿中，根据需要剪碎至1mm2的均匀体积块；

(2)胰腺组织块分离和消化：将剪碎的胰腺组织块中放入0.5mg/ml胶原酶IV和0.01mg/ml DNA酶I消化液中，置于37℃恒温摇床中消化1.5h后，取出，吸出消化液，过100μm的尼龙滤网到新的15ml离心管中，1500rpm/5min,收集细胞；

(3)密度梯度离心：将4ml80％的percoll溶液加入到15ml的离心管中，离心管倾斜60度，然后将用8ml40％的percoll溶液重悬的细胞轻轻缓慢沿管壁加入流至80％的percoll溶液的液面之上，所述4ml80％及8ml40％的percoll溶液由RPMI-1640完全培养基稀释，两层液体间可见清晰的分界面；在25度、400g、25min、升速为1、降速为0的条件下离心；离心后可见分界面有一层模糊状的细胞；吸取最上层少许液体弃掉，吸分界面中间细胞层液体至新的15ml离心管中，加入磷酸盐缓冲溶液至15ml，上下颠倒混匀；离心，常温、1500rpm/5min，弃去上清液，用磷酸盐缓冲溶液重悬沉淀，即得所需细胞。

采用酶消化提取小鼠胰腺淋巴细胞，提取步骤简化、高效、稳定，获取细胞的数量多、活率高、纯度高，为研究胰腺相关炎症或肿瘤疾病的分子免疫学机制提供可靠方法，为胰腺疾病发病机制的阐明奠定坚实的基础。

附图说明

图1为台盼蓝染色法检测获得小鼠胰腺内浸润的免疫细胞的活细胞数量

图2为Annexin V/PI凋亡试剂检测获得小鼠胰腺内浸润的免疫细胞的细胞活率

图3为CD45、CD3、CD4、CD8、CD19抗体标记检测获得小鼠胰腺内浸润的免疫细胞的细胞类型的比例

具体实施方式

1材料和方法

1.1实验动物:C57BL/6雄性鼠,6～8周龄，购于上海斯莱克动物中心，饲养在SPF级动物房内。

1.2主要试剂及器材：

试剂：RPMI1640培养液(美国Gibco公司)，胎牛血清(ICP，New Zealand)，1XPBS(磷酸盐缓冲液,0.01mol/L),anti-mouse CD45单克隆抗体，anti-CD3单克隆抗体,anti-mouse CD4单克隆抗体,anti-mouse CD8单克隆抗体,anti-mouse CD19单克隆抗体(美国BD)；胶原酶IV消化液(50mg/ml)；DNA酶I(1mg/ml)；

Percoll分离液等。

器材：15ml、50ml离心管；细胞培养皿；手术器械；Eppendorf离心机,Niko显微镜，BD FACSCantoTM II流式细胞仪等

1.3小鼠胰腺淋巴细胞分离方法

1.3.1胰腺组织块的准备：处死小鼠，取出胰腺，置于4℃装有磷酸盐缓冲溶液的3.5cm(直径)培养皿中(放置于冰上)，用磷酸盐缓冲溶液清洗1-2次，移至新的3.5cm培养皿中，根据需要剪碎至适度大小(1mm²)的均匀体积块；