[发明专利]线粒体DNA检测试剂在诊断奶牛脂肪肝的应用

说明书

一种线粒体DNA检测试剂在诊断奶牛脂肪肝的应用，属于生物技术领域。本发明的目的是通过设计特异性引物，提供检测奶牛全血中线粒体DNA的试剂用于制备奶牛脂肪肝血液学诊断的试剂盒。本发明设计了线粒体DNA的特异性引物和基因组DNA的特异性引物。本发明利用该试剂盒诊断脂肪肝简单易行，对奶牛影响小，可大规模用于集约化奶牛场围产期奶牛脂肪肝的筛查和早期预警。可以特异性的检测奶牛全血中线粒体DNA含量，有效用于临床奶牛脂肪肝的诊断。

技术领域

本发明属于生物技术领域。

背景技术

围产期（分娩前3周到分娩后3周的一段时间）奶牛经历妊娠、分娩启动泌乳等应激导致能量需求增加，而干物质摄入量减少，导致能量负平衡，进而引起机体的脂肪动员。脂肪组织中的甘油三酯发生水解，形成游离脂肪酸和甘油。游离脂肪酸释放入血后，被肝脏大量摄取。肝脏摄取的脂肪酸有四个去向：经三羧酸循环完全氧化、不完全氧化生成酮体、合成甘油三酯并包装成极低密度脂蛋白运输出肝脏（反刍动物此功能有限）或合成甘油三酯并储存在肝脏。当乙酰辅酶A的量不足以进行三羧酸循环时，游离脂肪酸便会沉积合成甘油三酯，而这正是脂肪肝综合征的起始过程。我国奶牛脂肪肝的发病率在35%以上，高产奶牛高达48%，且有逐年上升的趋势。脂肪肝会在不同程度上降低产奶产量和乳品质，此外还能损害生殖系统和免疫系统，导致免疫抑制，增加奶牛乳房炎和子宫内膜炎等感染性疾病的发病率。因此，脂肪肝一直以来被世界各国列为重要的奶牛疾病。

肝组织活检技术是目前奶牛脂肪肝诊断的金指标。根据肝脏甘油三酯（TG）的含量（%湿重），可判断脂肪肝的程度；肝脏中TG含量比上肝脏湿重，在1%-5%为轻度，5%-10%为中度，大于10%为重度。但肝组织活检属于介入性诊断技术，对奶牛产生的损伤和应激大，很难被奶牛场的管理者所接受，在很大程度上限制了其应用，寻找适合兽医临床需要的非介入性诊断方法和技术已成为奶牛脂肪肝研究的热点。

发明内容

本发明的目的是通过设计特异性引物，提供检测奶牛全血中线粒体DNA的试剂用于制备奶牛脂肪肝血液学诊断的试剂盒。

本发明特异性引物为：

线粒体DNA的特异性引物：

上游：5’- CGCGGTCATACGATTAACCC -3’；

下游：5’- AACCCTATTTGGTATGGTGCTT -3’；

基因组DNA的特异性引物：

上游：5’- GGTCCTGGCATCTTGTCCAT -3’；

下游：5’- TGGCAGTGCAAATGAAAAACTG -3’。

本发明特异性引物的制备方法：

设计特异性的qRT-PCR引物，在qRT-PCR反应中直接完成模板链的延长，引物设计原则：（1）引物长度一般为15-30个碱基；（2）引物的3’末端不互补；（3）引物分子内不互补；（4）G+C含量在40%-60%之间；（5）产物大小为70-300个碱基；通过NCBI查询线粒体DNA的GenBank序号为：LC104807.1，设计的线粒体DNA的特异性引物； 通过NCBI查询基因组DNA的NCBI Reference Sequence序号为：NM_178320.2；设计的基因组DNA的特异性引物。

本发明线粒体DNA特异性引物试剂盒：线粒体DNA的特异性引物、基因组DNA的特异性引物；荧光染料SYBR-GREEN。

本发明线粒体DNA引物试剂在诊断奶牛脂肪肝的应用。

本发明利用该试剂盒诊断脂肪肝简单易行，对奶牛影响小，可大规模用于集约化奶牛场围产期奶牛脂肪肝的筛查和早期预警。可以特异性的检测奶牛全血中线粒体DNA含量，有效用于临床奶牛脂肪肝的诊断。

具体实施方式