[发明专利]一种犬用精液冷冻稀释剂及冷冻方法

说明书

本发明公开了一种犬用精液冷冻稀释剂及冷冻方法，属于精液冷冻技术领域。该犬用精液冷冻稀释剂组成成分为：Tris 0.1~1.2 g,葡萄糖0.1~2.9 g，柠檬酸0.1~1.36 g,卵黄0~20 mL，LDL 1~8 g，PCS 0~0.1 g，N,N‑二甲基酰胺0~1.0 g，前列腺素0~0.1 mg，VE 0.1~1.5 g，复合VB 0.1~1.5 g，甘油0~6 mL，青霉素0~0.05 g，链霉素0~0.025 g，加双蒸水至100mL。本发明可以使得精子的前向性、直线速率、鞭打频率等指标显著提高，犬精液的精子活率、精子膜完整性和精子DNA完整性也得到提升。

技术领域

本发明属于精液冷冻技术领域，尤其涉及一种犬用精液冷冻稀释剂及冷冻方法。

背景技术

我国犬种资源丰富，品种繁多，其中北京犬、西施犬、沙皮犬、藏獒等品种列为世界名犬，还有通过各种途径从国外引进的优良品种如贵宾犬、博美犬等。珍惜这些犬种资源对我国犬业健康发展至关重要。但近年来在经济利益的驱使下，许多名贵犬种被大量无序繁殖，但都“重量不重质”，小群体近亲繁育等现象导致这些犬品种混杂，良莠不齐，优良纯种个体严重缺乏，严重影响了犬的性能，繁殖力降低，群体性能差异大。 利用人工授精技术结合开放式核心群育种以及现代分子育种技术等方法可以做好这些优良犬种的血统保纯工作，促进我国犬业的健康持续发展。

牛羊猪等家畜的人工授精技术早已普及应用，而犬的冷冻精液技术在国内仍然处于研究阶段，犬的冷冻精液稀释剂、冷冻技术不成熟导致犬的冻精解冻后精子活力低、授精后受孕率低，例如常规的冷冻稀释剂常常加入的卵黄、甘油成分，会抑制精子呼吸，降低精子活率。远远落后于国外的人工授精技术。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术中存在的缺点与不足，提供一种犬用精液冷冻稀释剂及冷冻方法。

本发明所采用的技术方案是：

一种犬用精液冷冻稀释剂，其组成成分为：Tris 0.1~1.2 g, 葡萄糖 0.1~2.9 g，柠檬酸 0.1~1.36 g, 卵黄0-20 mL，LDL 1~8 g，PCS 0~0.1 g，N, N-二甲基酰胺0~1.0 g，前列腺素0~0.1 mg，VE 0.1~1.5 g，复合VB 0.1~1.5 g，甘油0~6 mL，青霉素0~0.05 g，链霉素 0~0.025 g，加双蒸水至100mL。

根据上述冷冻稀释剂进行精液冷冻的方法，步骤如下：

(a)采用手握按摩法采取雄犬的精液，采集后迅速检测精液品质，精液冷冻前精液活率大于90%，密度大于1.0*108个/mL，畸形率小于5%，精子膜完整性大于85%，精子DNA完整性大于90%；

(b)先将不含有甘油的冷冻稀释剂按1:1比例稀释精液，采用水浴降温的方法由室温经过2h缓慢降温到4℃，加入甘油，平衡2h ，然后分装到0.25ml细管，将细管放入-70℃冰箱冻存15min，再将细管铺平在距离液氮面2cm处熏蒸6min，放入液氮罐中保存。

(c)精液冷冻一周后将细管投入40℃的温水中10秒后取出，检测精液品质。

优选的，所述的一种犬用精液冷冻稀释剂，其组成成分为：Tris 1.2 g，葡萄糖2.9 g，柠檬酸 1.36 g，卵黄 0 mL，LDL 8 g，PCS 0.1 g，N, N-二甲基酰胺 1 g，前列腺素0.1 mg，VE 1.5 g，复合VB 1.5 g，甘油5 mL ，青霉素 0.05 g，链霉素 0.025 g，加双蒸水至100 mL。

上述所述的TRIS(Solarbio)为细管冻精封口粉，采购于日本东京，PCS为胆固醇硫酸脂钾盐，采购于扬州科能，前列腺素采购于扬州科能生物有限公司），VE采购于扬州科能生物有限公司， LDL为低密度脂蛋白，依据 Mo ussa 等所介绍的方法自制备用。