[发明专利]一种稻瘟病的生物防治方法

说明书

技术领域

本发明涉及水稻病虫害的生物防治技术领域，具体涉及一种稻瘟病的生物防治方法。

背景技术

水稻是中国第一大粮食作物，其产量占中国粮食产量的40％左右。而水稻3大病害包括稻瘟病、白叶枯病及稻纹枯病，其中稻瘟病是水稻生产上威胁最大的病害之一，由真菌梨抱霉菌感染引起，可发生在水稻整个发育时期。由于该病流行速度快，在适宜的环境条件下，短时间内即可造成大流行，给水稻生产带来巨大损失。目前，农业上主要采取抗病育种和化学药剂来逐渐控制稻瘟病。但由于稻瘟病菌的遗传背景复杂，易变异，抗病品种难跟上致病菌生理小种的变异速度，常常导致一个新的具有抗病性的水稻品种在种植几年后丧失抗性。而化学防治，不仅会污染环境，降低水稻质量，破坏生态，还导致病菌的耐药性不断增加从而降低防效。因此，探索新的方法来控制和解决稻瘟病越来越受关注。因此寻找稻瘟病有效的、低毒性、不受病原菌抗性影响的生物防治途径对于粮食安全至关重要。

发明内容

根据现有技术中存在的问题，本发明提供了一种稻瘟病的生物防治方法，具有低毒性、不受病原菌抗性影响，且对稻瘟病菌的抑制率高等优点。

本发明采用以下技术方案：

一种稻瘟病的生物防治方法，包括以下步骤：

步骤一：选取健康水稻叶片，剪成5cm的叶段，放入装有质量浓度75％乙醇的三角瓶中振荡洗涤2次后倒掉乙醇，加入无菌水浸泡30min后梯度稀释，得梯度稀释液；

步骤二：制备NA固体培养基，采用蛋白胨10.0g、牛肉粉3.0g、氯化钠5.0g、琼脂15.0g、葡萄糖2.5g，加蒸馏水溶解，定容至1L，PH调至7±0.1，分装后121℃灭菌20min；

步骤三：吸取梯度稀释液涂布于NA固体培养基上，待吹干后，在30℃的恒温培养箱中倒置培养48h，挑取单菌落，在NA固体培养基上梯度划线再次获得单菌落，将获得的单菌落保存于NA固体培养基试管斜面备用；

步骤四：制备LB液体培养液，在950ml去离子水中加入胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl10g，搅拌直至溶质溶解，用5mol/LNaOH调pH至7.0，用去离子水定容至1L，在15psi高压下蒸汽灭菌21min；

步骤五：NA固体培养基试管斜面上挑取单菌落，接种于LB液体培养液中，在180rpm、37℃的条件下振荡培养48h，然后在4℃、10000rpm/min离心15min，去除菌体，保留上清液，取500mL上清液溶于500mL、饱和度为80％的(NH₄)₂SO₄溶液中，放于4℃冰箱静置48h，析出絮凝状沉淀物，所述的絮凝状沉淀物再次在4℃，10000rpm/min离心15min，弃去上清液，保留沉淀物，用500mLPBS缓冲液悬浮沉淀物，并置于透析袋中透析过滤，析出物经过0.22um的细菌滤膜过滤，得到粗提蛋白质液；

步骤六：水稻种子用质量浓度70％的乙醇溶液浸泡2min，然后用质量浓度3％的次氯酸钠水溶液浸泡30min，期间用玻璃棒搅动，无菌水冲洗3次，第3次冲洗持续10min，过夜干燥，置于铺有两层湿润滤纸片的培养皿中，再放于37℃恒温培养箱培养4d直至发芽，最后将发芽的水稻种子播种于田地，在水稻生长的第10、20、50和80天向水稻叶面喷洒粗提蛋白质液。

优选的，步骤一中所述的梯度稀释共稀释2次，每次稀释2倍。

优选的，步骤五中所述的所述的透析袋规格为25KD。

优选的，所述的单菌落为芽胞杆菌。

本发明的有益效果在于：

1)芽胞杆菌能够分泌抗菌物质来抑制病原菌生长，并诱导植物防御系统抵御病原菌入侵，供试菌株对稻瘟病菌分生抱子的萌发、芽管的延长和附着胞的形成具有显著的抑制作用，本发明的菌株活性物质对稻瘟病菌有较强的抑制作用，对稻瘟病菌菌丝生长抑制率达到80％以上。

2)本发明的方法可以调控水稻植株的生长发育进程，包含有益的细茵群落在植株生长中具有促生、抗病、抗逆等功能。根据植物微生态理论，这些细菌和宿主之间在长期的进化过程中能够建立互惠互利的关系。从生物间巧生互作等关系考虑，这些细菌将更有利于生物的定殖，可更好地发挥生防作用。

3)本发明采用生物防治是发展绿色水稻产业的重要手段，芽胞杆菌是防治稻瘟病的重要生防微生物。从植物中寻找具有生物活性的化合物，直接将其发成为新农药，是目前农药研发的一条重要途径。

具体实施方式