[发明专利]接枝RGD短肽温敏可注射水凝胶及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种含有细胞的接枝RGD短肽温敏可注射水凝胶，其制备方法如下，首先由聚合后具有温敏性的单体M1、含有羧基基团的单体M2、引发剂M3与催化剂M4通过共聚反应制备含羧基官能团共聚物A；再由共聚物A、烯类单体M5、有机溶剂M6、有机合成脱水剂、亲核酰化催化剂与沉淀剂M7通过脱水酯化反应制备双键功能化聚合物B；再由双键功能化聚合物B与生物短肽M8通过无铜点击化学制备短肽功能化聚合物C；最后经过与细胞共混，制得含有细胞的接枝RGD短肽温敏可注射水凝胶；所述的聚合后具有温敏性的单体M1为甲基丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺、N-正丙基丙烯酰胺、N，N-二乙基丙烯酰胺、N-乙烯基己内酰胺、N-羟甲基丙烯酰胺中的任意一种；所述含有羧基功能团的单体M2为丙烯酸、甲基丙烯酸、衣康酸、丁烯酸、甲基丁烯酸、戊烯酸、己烯酸、庚烯酸中的任意一种或任意两种的混合物；所述的引发剂M3为过硫酸钾、过硫酸铵中的任意一种；所述的催化剂M4为四甲基乙二胺、亚硫酸钠中的任意一种；所述的烯类单体M5为丙烯酸羟乙酯、丙烯酸羟丙酯、丙烯酸羟丁酯、甲基丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酸羟丙酯中的任意一种或任意两种的混合物；所述的有机溶剂M6为二氯甲烷、四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜、乙酸丁酯中的任意一种；所述的有机合成脱水剂为二环己基碳二亚胺，所述的亲核酰化催化剂为4-二甲氨基吡啶；所述的沉淀剂M7为乙醚、正己烷、石油醚、苯、乙酸乙酯、苯甲酸丁酯、四氯化碳、丙醚、正戊烷中的任意一种；所述的生物短肽M8为c(RGDfC)、RGDC、CRGDFGPDC、c(RGDyC)、GRGDSPC中的任意一种。

2.一种含有细胞的接枝RGD短肽温敏可注射水凝胶的制备方法，包括下列步骤：

1)含羧基官能团共聚物A的制备：25℃下将聚合后具有温敏性的单体M1、含有羧基基团的单体M2依次加入到去离子水中搅拌溶解，配成质量浓度为4-12wt％的溶液，置于4℃冰水浴中搅拌，通入氮气20-40min，每隔10-15min依次加入引发剂M3，催化剂M4，取出后密封，置于20-30℃水浴中反应12-24h，将M1与M2的共聚物置于透析袋中透析3-6d，每8-12h更换一次去离子水，取出后冷冻干燥8-12h，得到共聚物A干燥粉末；

2)双键功能化聚合物B的制备：将步骤1)制得的共聚物A搅拌溶解在有机溶剂M6中，浓度为0.5-2wt％，每隔5-8min依次加入烯类单体M5和亲核酰化催化剂4-二甲氨基吡啶，活化20-30min后，滴加有机合成脱水剂二环己基碳二亚胺，20-30℃反应12-24h，将聚合物溶液浓缩至8-12mL，加入到沉淀剂M7中进行沉淀，得到固体，并将其常温搅拌溶于去离子水中，置于透析袋中透析3-6d，每8-12h更换一次去离子水，取出后冷冻干燥8-12h，得到双键功能化聚合物B干燥粉末；

3)无铜点击化学制备短肽功能化聚合物C：将步骤2)制得的共聚物B溶解于HEPES缓冲溶液中，共聚物B的浓度为0.5-3wt％，通入氮气20-40min，加入生物短肽M8粉末搅拌至溶解，在20-30℃条件下反应2-3h，置于透析袋中透析3-6d，每8-12h更换一次去离子水，冷冻干燥8-12h，得到短肽功能化的聚合物C；

4)包含细胞的接枝RGD短肽温敏可注射水凝胶的制备：将步骤3)制得的聚合物C进行灭菌，将其溶解在0.001-0.01M氯化钙和0.137M氯化钠的溶液中配成无菌盐溶液，其中聚合物C的浓度为4-10wt％，取2-5mL的细胞分散溶液，与2-5mL的聚合物C盐溶液混合，即制得包含细胞的接枝RGD短肽的温敏可注射水凝胶。

3.根据权利要求2所述的接枝RGD短肽温敏可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的步骤1)中单体M2的质量占单体M1与单体M2总质量的1-8％；引发剂M3和催化剂M4的质量分别占单体总质量的0.5-1.5％和0.1-0.3％；步骤2)中共聚物A在有机溶剂M6中的浓度为0.5-2wt％；烯类单体M5的用量为所加共聚物A质量的2-10％；亲核酰化催化剂4-二甲氨基吡啶和有机合成脱水剂二环己基碳二亚胺的量均为所加共聚物A质量的4-8％，使用时配置成质量分数为0.1-1wt％M6的溶液，沉淀剂M7用量为溶液浓缩后体积的8-12倍；步骤3)中的生物短肽M8的质量为共聚物B的质量的0.5-2％。