[发明专利]一种饮用水中隐孢子虫的检测方法及试剂盒

权利要求书

1.一种饮用水中隐孢子虫的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)饮用水的前处理

采用过滤器过滤饮用水，过滤器内的滤膜截留饮用水中微生物，然后采用有机溶剂溶解滤膜，待滤膜完全溶解后，加入缓冲液沉淀微生物，离心回收沉淀物；

(2)水样DNA提取

将沉淀物涡旋后形成悬浮物，加入裂解液进行冻融前处理，冻融前处理完成后加入蛋白酶用于破坏隐孢子虫卵囊外部结构，离心取上清液，上清液用于提取隐孢子虫卵囊DNA；

(3)qPCR检测

采用qPCR方法对隐孢子虫卵囊DNA进行扩增，根据扩增结果判断饮用水中是否感染了隐孢子虫，并能确定感染量。

2.根据权利要求1所述的饮用水中隐孢子虫的检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述滤膜为1～2μm孔径的混合醋酸纤维素滤膜，所述过滤器为盘式过滤器，所述有机溶剂为丙酮；所述缓冲液为磷酸盐缓冲液。

3.根据权利要求2所述的饮用水中隐孢子虫的检测方法，其特征在于，采用丙酮溶解滤膜的具体步骤为：收集滤膜于离心管中，加入丙酮，离心弃上清液，继续加入丙酮，再离心取沉淀，重复此操作2～3次，直至滤膜完全溶解。

4.根据权利要求2所述的饮用水中隐孢子虫的检测方法，其特征在于，在收集滤膜之前还包括以下步骤：依次用PBST缓冲液、体积分数为70％～100％的乙醇、超纯水清洗过滤器。

5.根据权利要求1所述的饮用水中隐孢子虫的检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述裂解液为ATL裂解液，所述裂解液与所述悬浮物的体积比为2.25:1；所述冻融前处理为在液氮和沸水中反复冻融5次，每次冻融为在液氮中2min，在沸水中2min。

6.根据权利要求1所述的饮用水中隐孢子虫的检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述蛋白酶为蛋白酶K，所述蛋白酶K与EP管中混合液的体积比为1:10；加入蛋白酶用于破坏隐孢子虫卵囊外部结构的具体步骤为：冻融前处理完成后加入蛋白酶K，55～60℃下水浴2.5～3.5h，然后在88～92℃下水浴15～25min，取出后冰浴1.0～1.5min；采用QIAamp DNA mini kit试剂盒提取上清液中的隐孢子虫卵囊DNA。

7.根据权利要求1所述的饮用水中隐孢子虫的检测方法，其特征在于，步骤(3)中所述qPCR方法为SYBR green染料法qPCR或Taqman探针法qPCR，SYBR green染料法qPCR和Taqman探针法qPCR所使用的引物对均为JVAF引物和JVAR引物，Taqman探针法qPCR所使用的探针为隐孢子虫探针，所述JVAF引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示，所述JVAR引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:2所示，所述隐孢子虫探针的核苷酸序列为SEQ ID NO:3所示。

8.根据权利要求1所述的饮用水中隐孢子虫的检测方法，其特征在于，根据扩增结果判断饮用水中是否感染了隐孢子虫的方法为：当扩增结果有Ct值时，则判断为阳性样品，表明饮用水中感染了隐孢子虫；当扩增结果无Ct值时，则判断为阴性样品，表明饮用水中没有感染隐孢子虫。

9.一种饮用水中隐孢子虫的检测试剂盒，其特征在于，包括SEQ ID NO:1所示的JVAF引物，SEQ ID NO:2所示的JVAR引物，蛋白酶K，ATL裂解液，2×power SYBR green Master mix，使用说明书，阳性对照，阴性对照；所述阳性对照为克隆有SSU rRNA基因的pMD18-T载体，所述阴性对照为无RNA酶与DNA酶的ddH₂O。

10.一种饮用水中隐孢子虫的检测试剂盒，其特征在于，包括SEQ ID NO:1所示的JVAF引物，SEQ ID NO:2所示的JVAR引物，SEQ ID NO:3所示的隐孢子虫探针，ATL裂解液，Universal Master MixⅡ，使用说明书，阳性对照，阴性对照；所述阳性对照为克隆有SSU rRNA基因的pMD18-T载体，所述阴性对照为无RNA酶与DNA酶的ddH₂O。