[发明专利]一种用于鉴定烟草对南方根结线虫抗性的瞬时表达载体

说明书

技术领域

本发明属于微生物基因工程技术领域，具体涉及一种用于鉴定烟草对南方根结线虫抗性的瞬时表达载体。

背景技术

烟草根结线虫病是世界烟叶生产中的主要病害之一。由于杀线剂农药(铁灭可等)的限制应用，抗病品种的利用已成为防治根结线虫病最有效的措施。我国烟草抗根结线虫病的育种还很薄弱，主要是应用美国抗根结线虫病的烤烟品种为亲本，开展兼抗性育种，因此具有抗根结线虫病特性的育成品种其抗性不高，在整个烤烟育种中始终没有针对烟草抗根结线虫病开展育种研究，其主要原因是传统的抗性鉴定技术难于适应大量育种材料鉴定的需求，且鉴定结果受环境影响较大，准确性不高，限制了烟草抗根结线虫病育种的开展。

1963年，美国人在抗南方根结线虫品种叶片上发现了一种严重的叶脉坏死病斑，经过鉴定将其确定为PVY-MSNR新的株系。国外研究人员通过人工接种PVY-MSNR，在抗南方根结线虫品种叶片上引起过敏性坏死反应(枯斑反应)，而在感病品种上未出现症状，以此来筛选抗线虫品种。把这项技术用于烟草抗病育种程序中，能够极大地缩短育种年限。

农杆菌介导的瞬时表达技术是目前研究基因功能的常用方法。瞬时表达技术可以实现目的基因短暂的高水平表达，与稳定遗传表达相比，具有操作简便、所需时间短、耗资少、且不受遗传转化难易的影响等优点。

发明内容

为解决传统的抗性鉴定技术难于适应大量育种材料鉴定的需求，且鉴定结果受环境影响较大，准确性不高的技术问题，本发明结合背景技术中的理论构建农杆菌瞬时表达载体，用于快速鉴定烟草根结线虫的抗性。同时，利用烟草抗根结线虫病基因鉴定技术在杂种分离世代辅助选择，并应用到烟草抗根结线虫病品种选育程序中，加速育种进程。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

一种用于鉴定烟草对南方根结线虫抗性的瞬时表达载体，是由SEQ ID NO.1所示序列通过5’Pstl和3’Sacl克隆至载体pCAMBIA2300-LIC获得。

一种所述用于鉴定烟草对南方根结线虫抗性的瞬时表达载体的构建方法，包括以下步骤：

(1)人工合成病毒PVY-NIB的CDNA片段：在PVY-NIB的CDNA片段序列中5’端加入克隆位点Pstl和3’端加入克隆位点Sacl，加入克隆位点后的序列为SEQ ID NO.1；

(2)pCAMBIA2300-LIC:PVY-NIB瞬时表达载体构建：将pCAMBIA2300-LIC空载体进行双酶切，并通过T4DNA连接酶将空载体pCAMBIA2300-LIC和步骤(1)中的加入克隆位点后人工合成的PVY-NIB的CDNA片段进行连接，构建pCAMBIA2300-LIC:PVY-NIB瞬时表达载体。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明通过人工合成PVY-MSNR株系复制酶基因PVY-NIB，以pCAMBIA2300-LIC为植物表达载体，构建农杆菌瞬时表达载体，建立新的烟草抗根结线虫病品种基因鉴定技术体系。实现简单、准确、快速、高通量的对烟草抗根结线虫的抗性筛选鉴定。

(2)本发明建立的新的瞬时表达载体用于烟草抗南方根结线虫育种程序中，能够极大地缩短育种年限。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。

一种用于鉴定烟草对南方根结线虫抗性的瞬时表达载体，是由SEQ ID NO.1所示序列通过5’Pstl和3’Sacl克隆至载体pCAMBIA2300-LIC获得。

一种所述用于鉴定烟草对南方根结线虫抗性的瞬时表达载体的构建方法，包括以下步骤：

(1)人工合成病毒PVY-NIB的CDNA片段：在PVY-NIB的CDNA片段序列中5’端加入克隆位点Pstl和3’端加入克隆位点Sacl，加入克隆位点后的序列为SEQ ID NO.1；

(2)pCAMBIA2300-LIC:PVY-NIB瞬时表达载体构建：将pCAMBIA2300-LIC空载体进行双酶切，并通过T4DNA连接酶将空载体pCAMBIA2300-LIC和步骤(1)中的加入克隆位点后人工合成的PVY-NIB的CDNA片段进行连接，构建pCAMBIA2300-LIC:PVY-NIB瞬时表达载体。

本发明中，植物表达载体pCAMBIA2300-LIC由韩国首尔大学Kim教授提供，载体大小约10490bp，载体抗性为Kan。

实施例1

一种所述用于鉴定烟草对南方根结线虫抗性的瞬时表达载体的构建方法，包括以下步骤：