[发明专利]FXa的检测试剂及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生化检测技术领域，尤其涉及FXa的检测试剂及检测方法。

背景技术

凝血因子X为维生素K依赖的丝氨酸蛋白酶原，在血液含量为100nM/L。凝血因子X被FIX激活后产生活化凝血因子X(FXa)。FXa在血管出血时被激活，其为体内凝血酶原唯一的生理性激活物，在血液凝固的连锁反应中起关键性作用。研究表明，FXa可以作为体内出血的标志物，与血管内膜增生和动脉粥样硬化有关，同时FXa与肿瘤细胞的转移有关。因此，快速准确的检测出FXa在血液水平十分重要。

随着酶联免疫吸附测定技术的发展，目前市面上已经有一些FXa ELISA KIT产品，通用的FXa检测试剂盒检测原理为双抗体夹心法。用纯化的FXa抗体包被微孔板，制备成固相抗体，检测时往包被单抗的微孔中依次加入待测物质，再与HRP标记的FXa抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色.颜色的深浅和样品中的待测FX呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，通过标准曲线计算样品中待测FXa浓度。但其ELISA检测法步骤较多，包括孵育、显色、洗板等过程，检测时间较长，通常在3～6h，这样的时间对于临床检测而言过长。另外，还有其他一些检测FXa的方法，例如，电化学法、凝固法或发色底物法。但这些方法都难免受到血浆中杂蛋白或血红色素的影响，容易产生误差。

因此寻找一种能够快速、准确测量样品FX含量的技术十分必要。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供FXa的检测试剂及检测方法。本发明提供的检测试剂能够实现对FXa快速、准确的检测。

本发明提供了一种FXa检测试剂，由金属结合蛋白AHP、Tb³⁺、Tris-HCl、Mg²⁺和水制得；所述金属结合蛋白与Tb³⁺的摩尔为1:(1～3)。

铽离子(Tb³⁺)能够与金属离子结合蛋白AHP结合，由于280nm激发蛋白质产生发射光谱与铽离子的激发光谱有重叠，二者之间存在荧光共振能量转移(FRET)，AHP作为供体，Tb³⁺作为受体。FRET程度与供、受体分子的空间距离紧密相关，距离增大，FERT越弱，Tb³⁺的荧光强度越低。镁离子(Mg²⁺)可以诱导FXa与AHP结合，结合后会使AHP在280nm的发光基团(酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸)与Tb³⁺之间的空间距离增大，从而使Tb³⁺的荧光强度降低。因此，AHP与Tb³⁺之间比例和分子量固定的情况下，FXa含量越高，Tb³⁺荧光强度越低，通过建立FXa与Tb³⁺荧光强度之间的关系，可以通过检测Tb³⁺的荧光强度判断样品中FXa的含量。

本发明中，所述金属结合蛋白AHP的浓度为4～6nmol/L。所述金属结合蛋白AHP的浓度为5nmol/L。

AHP与FXa结合体系中存在Tb³⁺和Mg²⁺的情况下，Mg²⁺结合FXa，与AHP不结合。而Tb³⁺与AHP的结合常数很高，在体系中AHP:Tb³⁺的摩尔比为1:(1～3)结合良好，在AHP:Tb³⁺的摩尔比为1:2的情况下，二者能够完全结合。本发明实施例中，所述金属结合蛋白与Tb³⁺的摩尔为1:2。

本发明中，所述Tb³⁺的来源为Tb(NO₃)₃·5H₂O。

本发明中，所述Tb³⁺的浓度为8～12nmol/L。

一些具体实施例中，所述Tb³⁺的浓度为10nmol/L。

本发明中，所述Mg²⁺的来源为MgSO₄。

本发明中，所述Mg²⁺的浓度为8～12μmol/L。一些具体实施例中，所述Mg²⁺的浓度为10μmol/L。