[发明专利]选择适配体的方法和利用差别亲和力的多重免疫分析

说明书

本发明提出了利用捕捉配体与目标分析物之间的结合对间的差别亲和力的多重免疫分析。描述了选择对目标分析物具有所需亲和力的适配体的窗口磁力辅助的快速适配体选择(窗口‑MARAS)方法，和通过利用所选适配体作为试剂中的捕捉配体来产生在一次分析中进行多重免疫分析或多重检测的试剂的方法，并且所述方法用于基于捕捉配体与目标分析物之间的结合对的差别亲和力，证实多重免疫分析的可行性。

技术领域

本发明大体上涉及一种利用差别亲和力(differential affinity)的多重免疫分析(multiplex immunoassay)方法和产生用于多重免疫分析的适配体类试剂(aptamer-based reagents)的方法。具体地说，本发明涉及一种产生适配体类试剂的磁力辅助的差别亲和力选择方法和一种使用适配体类试剂的利用差别亲和力的多重免疫分析方法。

背景技术

多重免疫分析已经广泛地用于基础生物医学研究中，因为其能够将大量不同的分析全部在单一反应容器中用相对较小的样品体积高效地进行。在多重免疫分析中，高亲和力高特异性的捕捉配体呈并行阵列固定在平面阵列中或编码的微米球上。当与样品一起培养时，目标分析物分别结合于对应的捕捉配体，并形成配体-目标复合物。在进行洗涤以去除未结合的物质后，与检测标记结合的报导配体附接到所结合的复合物。接着检测装置用于定量检测标记，接着使用预定校准曲线来转化成目标分析物的质量浓度。在单个实验中可分析的目标分析物的数目高达数百。因此，多重免疫分析变成基础生物医学研究中强有力的分析工具。但是，除了复杂性和昂贵外，仍然存在大量的问题和挑战，包含各种分析物的大量高度特异性捕捉配体的可用性、捕捉配体与分析物和分析稀释剂之间的交叉反应性、基质效应的干扰、当研发多个分析时所需的分析参数的折衷以及对用于检测的预先标记的报导分子的需求。

另一方面，出于临床诊断的目的，多重免疫分析也变得至关重要，因为其能够鉴别广泛疾病的多种生物标记物。即使多重免疫分析在一次分析中能够分析高达百种分析物，其在诊断疾病也只需要几种生物标记物(理想地，至多四种生物标记物)。需要发展一种特别用于临床应用的多重免疫分析平台。

包含结合袋(binding pockets)的适配体以高特异性和亲和力结合于多种目标分析物，从小分子(例如有机分子、离子、肽、蛋白质、核酸)、大分子甚至到全细胞、病毒、寄生虫或组织。一旦鉴别出用于目标分析物的适配体的序列，就可以通过化学合成来产生整个适配体。此外，经官能团修饰的适配体会增加其在可能对核酸有害的各种生物应用中的稳定性。适配体不仅潜在能够成为靶向致病性和恶性细胞或组织并取代抗体的优良工具，而且还可以用于纯化、诊断学、生物传感器和抗感染剂。因为适配体在许多方面具有潜能，所以已经发展一种有效选择方法—磁力辅助的快速适配体选择(Magnetic-Assisted RapidAptamer Selection,MARAS)，所述方法足够简单明了，从而快速筛选对目标分析物具有高亲和力和特异性的适合适配体。

发明内容

本发明的一些方面涉及利用捕捉配体与对应的目标分析物之间的差别亲和力的多重免疫分析。本发明的一些方面涉及用于合成能够在一次分析中进行多重检测的适配体类试剂的方法。并且，本发明的一些方面涉及一种特别用于临床应用的多重免疫分析平台，其使用适配体类试剂，利用差别亲和力，具成本低，操作简单，并且分析时间快。

本发明的一些方面提供了用于在单次分析中检测和/或定量多种分析物的方法，具体地说，基于差别亲和力(结合力)的多分析物分析。本发明的分析采用捕捉配体与目标分析物之间的结合对的差别亲和力来区别测试样品中不同的所捕捉的分析物并进行定量。

本发明的一些方面涉及使用窗口-磁力辅助的快速适配体选择(window-MARAS)来选择对不同目标分析物具有所需亲和力的单个适配体、合成能够在一次分析中进行多重检测的适配体类试剂并使用适配体类试剂检测和定量样品中的多种分析物的方法。窗口-MARAS是一种MARAS程序，其利用外部施加的振荡磁场的下限和上限频率/强度来从寡核苷酸库选择对目标分析物具有所需亲和力范围的适配体。