[发明专利]深层细胞超分辨率成像的方法、系统及棱镜光薄片装置

说明书

本申请是申请日为2014年11月20日、申请号为201410669870.8、发明名称为《深层细胞超分辨率成像的方法、系统及棱镜片薄片装置》的分案申请。

技术领域

本发明涉及光学显微技术和生物细胞成像技术领域，尤其涉及一种深层细胞超分辨成像方法及棱镜光薄片装置。

背景技术

超分辨率(Super-Resolution)定位显微术可提供近分子级别的分辨率。这一技术的发展极大地推进了人们对细胞内结构的理解。但是，在本质上这一技术依赖于对单个荧光标记分子的成像和精确定位，并且需极高的图像SNR(Signal to Noise Ratio，信噪比)来保证定位的精度。定位显微术(Localization Microscopy，LM)通常使用全内反射(Total Internal Reflection，TIRF)或近全内反射(near-TIRF)方法，通过限制照明区域的深度来降低背景噪音，因此该方法的成像区域受限于样品载玻片表面以上几微米以内。

目前，对于高自发荧光或结构密集的细胞或者组织的深层成像仍然依赖于其他技术如共聚焦显微镜(Confocal Laser Scanning Microscope，CLSM)。在另一方面，近期开发的超分辨率光学波动显微术(Localization Microscopy，LM)通过应用计算高阶相关度来分析每个荧光标记分子的信号波动，从而减小每个分子的点扩散函数(point spread function)，并以此来提高分辨率。此技术的分辨率和高阶相关运算的阶次开方成正比，因此理论上可通过提高运算阶次来进一步增加分辨率，但是在现实中其分辨率极限为100纳米。另外，由于荧光标记物的信号只和自身相关，和其他层面分子所产生的背景信号并无相关性，该方法所使用的高阶相关运算可有效的消除背景噪音，从而实现光学切片成像。

目前切片成像技术在生物学研究中扮演着重要角色。扫描共聚焦显微镜(以及转盘共聚焦)作为主要的切片成像手段已经存在了25年。这一技术利用小孔来滤除非成像平面的背景信号。目前已有的受激辐射损耗显微技术就是基于扫描共聚焦显微镜开发而成的超分辨率显微技术。其分辨率可达50纳米。这一技术的局限在于所拍摄样品必须能够承受极高的激光照射因此限制了可供拍摄样品的种类。

利用光片技术从样品的侧向照明同样可实现切片成像，和共聚焦技术相比，该方法可在很大程度上减小细胞所承受的光强。另外已有文献声称结合定位显微术和光片技术实现超分辨率成像并取得40纳米的分辨率。但是目前受限于由于照明与探测的几何结构问题，这一技术仍然很难被应用于拍摄更普遍的生物样品。

综上可知，现有技术在实际使用上显然存在不便与缺陷，所以有必要加以改进。

发明内容

针对上述的缺陷，本发明的目的在于提供深层细胞超分辨率成像的方法、系统及棱镜光薄片装置，其能够在不改变现有显微镜结构的基础上，实现深层细胞超分辨率成像。

本发明提供的第一种深层细胞超分辨率成像的方法，应用于超分辨率定位显微镜中，所述方法包括步骤有：

将荧光标记物连接待观察的样品，并将所述样品浸泡在成像缓冲液中；

获取所述样品深层的荧光标记分子闪烁的荧光信号；

通过超分辨率光学波动显微算法消除所述荧光信号的背景噪音；

通过超分辨率定位显微算法计算经降噪处理的所述荧光信号的位置；

根据所述荧光信号的位置构建所述样品的深层细胞超分辨率图像。

根据本发明所述的方法，所述通过超分辨率光学波动显微算法消除所述荧光信号的背景噪音的步骤包括：

通过二阶或高阶相关度分析算法处理所述荧光信号，以去除所述荧光信号中非关联的所述背景噪音；

所述通过超分辨率定位显微算法计算经降噪处理的所述荧光信号的位置的步骤包括：

通过高斯拟合、最大相似度或者寻找质量中心算法计算经降噪处理的所述荧光信号的中心位置。

根据本发明所述的方法，所述通过超分辨率光学波动显微算法消除所述荧光信号的背景噪音的步骤进一步包括：

将所述荧光信号记录成动画；

将所述动画重组为一系列的动画组，每个所述动画组包含预定个数的帧；

通过所述超分辨率光学波动显微算法对每个所述动画组进行二阶相关度运算，以去除所述荧光信号中非关联的所述背景噪音；

将经降噪处理的所述动画组重组为新动画；

所述通过超分辨率定位显微算法计算经降噪处理的所述荧光信号的位置的步骤进一步包括：