[发明专利]RT-qPCR检测树鼩SLC2A9/Glut9基因转录水平的方法

权利要求书

1.一种RT-qPCR检测树鼩SLC2A9/GLUT9基因转录水平的方法，其特征在于包括下列步骤：

（1）设计下列引物：

树鼩SLC2A9/GLUT9基因表达水平的特异性上、下游引物为：

SLC2A9/GLUT9 F：5’- ACAATGAAGCAGGAGCGACA -3’

SLC2A9/GLUT9 R：5’- ACTCAGGGTGATGTACGGGA-3’

作为内参基因的树鼩GAPDH基因的特异性上、下游引物为：

GAPDH F：5＇-AGCCCCATCACCATCTTCC-3＇

GAPDH R：5＇- AATGAGCCCCAGCCTTCTC -3＇；

（2）以树鼩新鲜肾脏组织提取的总RNA为模板，按常规逆转录合成得树鼩肾脏组织cDNA第一链；

（3）以步骤（2）的树鼩肾脏组织cDNA第一链为cDNA模板，以步骤（1）中的SLC2A9/GLUT9F和SLC2A9/GLUT9R上、下游引物以及GAPDH F和GAPDH R上、下游引物为特异性引物，分别在下列PCR扩增体系及反应条件下进行实时荧光定量PCR扩增，扩增结束后根据荧光信号的数据，分别获得SLC2A9/GLUT9基因片段及内参基因GAPDH片段的Ct值及溶解峰；

所述PCR扩增体系及反应条件如下：

PCR扩增体系即25μL体系：

SYBR Premix Ex Taq II 酶 12.5μL，cDNA模板1μL，SLC22A12/URAT1 F和SLC22A12/URAT1 R上、下游引物各1μL，去离子水9.5μL；

SYBR Premix Ex Taq II 酶 12.5μL，cDNA模板1μL，GAPDH F和GAPDH R上、下游引物各1μL，去离子水9.5μL；

反应条件：94℃预变性30s，94℃变性5s、60℃退火30s、40个循环，59℃到94℃每5s采集一次荧光信号；

（4）将步骤（2）的树鼩肾脏组织cDNA第一链稀释为10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4倍浓度作为cDNA模板，以步骤（1）中的SLC2A9/GLUT9 F和SLC2A9/GLUT9R上、下游引物以及GAPDH F和GAPDH R上、下游引物为特异性引物，分别按步骤（3）的PCR扩增体系及反应条件进行荧光定量PCR扩增，反应结束后根据荧光信号的数据，获得Ct值，通过qPCR仪器自带CFXManager 软件建立SLC2A9/GLUT9基因及内参基因GAPDH的溶解曲线及标准曲线，得到SLC2A9/GLUT9基因片段及内参基因GAPDH片段的扩增效率、斜率及R² 值；

（5）在步骤（3）的PCR扩增体系及反应条件下，以步骤（2）的树鼩肾脏组织cDNA第一链作为待测样品cDNA模板，进行实时荧光定量PCR扩增，得到对应的Ct值，将该Ct值以及步骤（4）得到的SLC2A9/GLUT9基因及内参基因GAPDH的扩增效率，通过qPCR仪器自带CFX Manager软件处理，得出均一化后的SLC2A9/GLUT9基因倍数表达的ΔΔC(t)值，从而获得SLC2A9/GLUT9基因转录水平相对表达值。