[发明专利]一种能高效分解甲酰胺和氧化亚磷酸盐的重组大肠杆菌及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种能高效分解甲酰胺和氧化亚磷酸盐的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）设计引物，PCR扩增甲酰胺酶基因

上游引物A1即5'-CGCGGATCCGATGAACGGACTGGGCGGCTTGAAC-3'，下划线斜体为BamH I酶切点；下游引物A2即5'-CCGGAATTCCGTCGCGCCGCGCCTCCCTTCGCTC-3'，下划线斜体为EcoR I酶切点；

以保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO: M2014458的类芽孢杆菌（Paenibacillus pasadenensis.） CS0611的基因组为模板，克隆出1011 bp的甲酰胺酶基因序列，命名为for；将克隆得到的基因序列for连接到载体pETDuet-1上的第一个多克隆位点，再将重组载体转化到大肠杆菌DH5α，得到含有重组载体pETDuet-for的重组大肠杆菌DH5α；

（2）设计引物，PCR扩增亚磷酸脱氢酶基因

上游引物B1即5'-GAAGATCTGATGCTGCCGAAACTCGTTATAACTC-3'，下划线斜体为Bgl Ⅱ酶切点；下游引物B2即5'-GGGGTACCACATGCGGCAGGCTCGGCCTTGGGC-3'，下划线斜体为Kpn Ⅰ酶切点；

以保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO. M 2017449肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumonia. ）OU7的基因组为模板，克隆出1008bp的亚磷酸脱氢酶基因序列，命名为ptx；将克隆得到的基因序列ptx连接到pETDuet-for的第二个多克隆位点上，得到甲酰胺酶基因for和亚磷酸脱氢酶基因ptx同时连接到同一表达质粒的重组质粒，命名为pETDuet-for-ptx；将重组质粒pETDuet-for-ptx转化入重组大肠杆菌DH5α；

（3）转化表达重组菌株

从重组大肠杆菌DH5α中提取重组质粒pETDuet-for-ptx，并将重组质粒pETDuet-for-ptx转化入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中；

（4）诱导培养重组大肠杆菌

将得到的重组表达菌株BL21(DE3)接种到LB培养基中，进行诱导培养后，收集菌体并加入到含有甲酰胺和亚磷酸盐的MOPS培养基中，继续培养得到重组大肠杆菌。

2.根据权利要求1所述的一种能高效分解甲酰胺和氧化亚磷酸盐的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，步骤（1）中，所述类芽孢杆菌Paenibacillus pasadenensis. CS0611的甲酰胺酶基因序列如SEQ ID NO.1所示，片段长度为1011 bp，编码337个氨基酸；所述类芽孢杆菌Paenibacillus pasadenensis. CS0611于2014年10月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO: M2014458。