[发明专利]尿来源间充质干细胞的提取及扩增培养方法

说明书

本发明公开了一种尿来源间充质干细胞的提取及体外扩增培养的技术方法，主要是通过从无菌尿液中分离获得间充质干细胞，并采用易于配制的培养基体外进行扩增。用本发明提取及扩增培养的尿来源间充质干细胞可用于临床免疫相关疾病的治疗及多种组织器官的损伤修复。本发明的优势在于尿来源间充质干细胞分离和提取过程完全无创，无需特殊仪器，成本低，提取过程易于被患者接受。本发明的尿来源间充质干细胞另一个优势是可进行自体移植，无免疫排斥反应、无伦理争议，能避免疾病传播风险。尿来源间充质干细胞显示出良好的扩增能力，能满足细胞治疗时所需的细胞数量。

技术领域

本发明涉及一种尿来源间充质干细胞的提取和体外扩增培养方法，属于细胞生物学、再生医学及组织工程领域。

背景技术

间充质干细胞(MSCs)是一类中胚层来源的多能成体干细胞，具有低免疫原性、多向分化潜能及免疫调节作用。目前，间充质干细胞被越来越多的应用于治疗临床难治性的免疫性疾病，为免疫性疾病的治疗提供了新的思路和方向。与此同时，MSC作为理想的种子细胞，与再生医学和组织工程技术相结合，为组织的再生和修复提供了新的手段。

间充质干细胞最早由骨髓分离提取。随着研究的进一步深入，目前研究人员能够从脐带、脐血、脂肪、滑膜等组织中分离提取间充质干细胞。但传统的间充质干细胞取材始终存在取材不便、有创性、成本较高的缺点，并且伦理问题也是阻碍间充质干细胞应用的重要原因之一。因此，寻找一种更理想来源的间充质干细胞显得尤为迫切。尿来源间充质干细胞(USCs)具有稳定表达间充质干细胞相关细胞表面标志物、多向分化潜力和免疫调节功能的特性。与传统间充质干细胞来源相比，其收集方法简单、非侵袭性、安全、成本低，且便于自体移植从而避免伦理问题，易于推广应用，是理想的间充质干细胞来源。

发明内容

本发明的目的在于提供一种尿来源间充质干细胞的提取及体外扩增培养方法。为了实现本发明的目的，本发明采用了以下技术方案：

1尿液获取：无菌条件下，收集清洁中段非晨尿200ml，立即进行下一步骤；

2初步离心：将清洁尿液分装至50ml离心管中，4℃，400g离心10min；

3洗涤：用含有抗生素的基础培养基充分洗涤沉淀，4℃，300g离心5min；

4用1ml完全培养基重悬，种入24孔板中，置于细胞培养箱中培养；

5细胞扩增：培养3天后，显微镜下观察，如观察到细菌污染则弃去，无污染则换液，继续培养。5-7天后，可见多个单个细胞贴壁生长。标记长梭形单细胞克隆位置，随后每隔2天换液，培养14-21天直至多个单细胞克隆达到70％融合。随后，采用0.25％胰蛋白酶消化约3min，完全培养基终止，800rpm，5min离心，2ml完全培养基重悬细胞，转移至六孔板中继续培养；

6细胞表面标记物的鉴定：通过流式检测，尿来源间充质干细胞表达CD105，CD73，CD90，不表达CD45，CD34，CD11b，CD19，HLA-DR；

7细胞诱导分化：分别取3-5代的尿来源间充质干细胞，与成骨细胞诱导分化培养基和成脂诱导分化培养基共培养14-21天，分别采用茜素红S和油红O染色检测其向成骨细胞和脂肪细胞分化的能力。

上述尿来源间充质干细胞的提取及扩增培养方法中，所述抗生素为含有100U/ml的青霉素和0.1mg/ml的链霉素的抗生素。

上述尿来源间充质干细胞的提取及扩增培养方法中，所述细胞培养箱的培养条件是：温度37℃，5％CO2饱和湿度。

上述尿来源间充质干细胞的提取及扩增培养方法中，所述完全培养基包含：Lonza12-725培养基、10％胎牛血清、1％L-谷氨酰胺及100U/ml的青霉素和0.1mg/ml的链霉素的抗生素。