[发明专利]一种酶反应检测纳米孔电学传感器

说明书

本发明公开了一种酶反应检测纳米孔电学传感器，包括从下到上依次层叠的基底、绝缘层以及中心设有纳米尺度孔的薄膜，其特征在于，在所述纳米尺度孔内通过化学修饰有DNA探针以及与DNA探针互补杂交的DNA四面体结构，在所述DNA四面体结构上通过生物素结合有辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，从而使单个辣根过氧化物酶固定在纳米孔内。通过加入反应底物，检测氧化反应产物易位事件，实现对酶反应的实时监测。本发明解决了当前酶反应检测的大量的试剂与时间消耗问题，同时本发明提供的纳米孔内酶固定方法能为后期在纳米孔内研究单个酶分子动力学提供研究思路。

技术领域

本发明涉及一种酶反应检测纳米孔电学传感器技术，属于纳米孔电学传感器技术领域。

背景技术

纳米孔传感是一项研究广泛的新型传感检测技术，涉及单分子随机传感、医学筛查和诊断等。纳米孔传感检测技术起源于库尔特计数和细胞离子通道原理。在纳米孔传感检测中，纳米孔或纳米通道(通常指小于100nm)通常位于一个绝缘的薄膜上，该薄膜将流体池一分为二，形成两个单独的离子溶液池，即顺式面(Cis)和反式面(Trans)。当在这两侧施加一个稳定的偏置电压时，将会产生一个稳定的从孔的一侧到另一侧的离子电流。当有带电分子通过纳米孔时会产生电流阻塞，通过检测与分析阻塞电流的形态能够分析出过孔分子的理化特性。

纳米孔根据其材料组成主要可以分为两大类：生物纳米孔以及人造固态纳米孔。生物纳米孔已经被广泛应用于单分子检测、疾病诊断以及DNA测序当中。最近几年纳米科学技术的快速发展促使了人造固态纳米孔的实现。与生物纳米孔相比，其具有更大的灵活性，例如形状、大小和表面性质可控等。目前，固态纳米孔的应用正在成为研究的焦点。固态纳米孔的直径根据需要可以精确控制在亚纳米到几百纳米。通常，固态纳米孔都是在绝缘的材料上制备的，其在各种极端的溶液中都非常稳定。

随着纳米孔技术的发展，简单的应用纳米孔进行简单的分子检测已经不能满足人们的需求，新制备的固态纳米孔内表面的材质不能与待测分子产生特异性的识别位点，限制了它的应用，然而化学修饰纳米孔传感解决了这一问题。通过化学表面改性或者修饰特异性的基团，可以极大地扩大分析物的范围，并能够实现无标记、在线实时监测生物分子动态相互作用等。这种方法赋予了纳米孔新的功能，很大程度上提高了纳米孔的选择性和灵敏性。随着功能化纳米孔技术的发展，应用纳米孔技术研究酶反应动力学正在成为研究的热点。当前，应用纳米孔对酶的研究大部分仅仅局限在通过酶分子过孔事件来检测酶分子的构象变化，及其将大量酶分子固定在孔内检测反应的发生，这些方法试剂的消耗量大，并只能对大量的酶分子进行统计的分析，不能实现在单分子分辨率下对酶催化反应的研究。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足，而提出一种试剂消耗少、能实现少分子甚至是单分子分辨率下对酶催化反应的酶反应检测纳米孔电学传感器。

为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

一种酶反应检测纳米孔电学传感器，包括从下到上依次层叠的基底、绝缘层以及中心设有纳米尺度孔的薄膜，其特征在于：在所述纳米尺度孔内固定具有单个辣根过氧化物酶的DNA四面体结构，在所述纳米尺度孔内通过化学修饰有DNA探针以及与DNA探针互补杂交的DNA四面体结构，在所述DNA四面体结构上通过生物素结合有辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素。

所述DNA探针由30个碱基组成，其5’端修饰有羧基。

所述带有DNA探针的DNA四面体结构由包含114个碱基的第一单链DNA序列、包含114个碱基的第二单链DNA序列、包含104个碱基的第三单链DNA序列、包含114个碱基的第四单链DNA序列碱基配对杂交合成，并在四个顶点处各剩余一段未杂交的DNA 序列作为第一固定探针、第二固定探针、第三探针及第四固定探针；其中第一固定探针、第二固定探针及第四固定探针碱基序列相同，用于与修饰在纳米孔壁面上的DNA探针进行杂交；所述第三探针在5’端修饰有一个生物素。