[发明专利]一种胎盘血造血干细胞的培养方法

说明书

本发明公开了一种胎盘血造血干细胞的培养方法，包括以下步骤：(1)采集胎盘血，通过0.3‑1.0wt％的氯化钠溶液稀释，0.3‑1.0wt％的甲基纤维素溶液沉淀，再用浓度为12‑16％的人AB血浆重悬和分离液分离纯化，获得单个核细胞；(2)向单个核细胞重悬液中加入CD34⁺抗体孵育，然后加入CD34⁺免疫磁珠孵育，用新洗涤液洗涤后置于磁场中，静置，得CD34⁺细胞；(3)将CD34⁺细胞接种于胎盘血造血干细胞培养基中培养，获得细胞。该培养方法稳定有效，使得造血干细胞能够长久处于增殖不分化状态，避免造血干细胞在增殖过程中分泌大量氧化产物促使细胞凋亡的问题，提高了造血干细胞的扩增率和细胞活性。

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种胎盘血造血干细胞的培养方法。

背景技术

造血干细胞是血液系统中的成体干细胞，是一个异质性的群体，具体长期自我更新的能力和分化成各类成熟血细胞的潜能。它是研究历史最长且最为深入的一类成体干细胞，对研究各类干细胞，包括肿瘤干细胞，具有重要指导意义。由于造血干细胞具有多向分化的潜能，将造血干细胞移植到体内是治疗白血病、淋巴瘤等恶性肿瘤、代谢性疾病、自身免疫性疾病及先天免疫缺陷等严重危害人类健康疾病的有效方法，可以有效的减轻患者的痛苦。但是，由于造血干细胞在体内的数量极少，大大的限制了造血干细胞在临床中的应用。

随着医学和生物技术的发展，近年来发现胎盘含有大量的造血干细胞，且所含造血干细胞数量很高，而且移植胎盘造血干细胞的配型要求不需要很严格，移植后反应较轻且不需要采用药物等优点，从胎盘血中提取造血干细胞的方向成为领域内的研究方向。

目前，提取出的造血干细胞的体位增殖途径主要有两种，一种是通过基质的灌注进行体外培养；第二种是将造血干细胞接种于造血干细胞培养基进行体外培养。但采用这两种方法培养的造血干细胞大多存在活性和增殖能力较差的问题，且细胞易分化。因此，现急需研究一种能够提高造血干细胞的扩增率和细胞活性的培养方法。

发明内容

针对现有技术中的上述不足，本发明提供了一种胎盘血造血干细胞的培养方法，可有效解决现有的培养方法培养的造血干细胞活性和增殖能力较差的问题。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种胎盘血造血干细胞的培养方法，包括以下步骤：

(1)采集胎盘血，加入等体积的稀释液进行稀释，得胎盘血稀释液，接着向胎盘血稀释液中加入质量百分数为4-8％的沉淀液进行沉淀，然后离心，弃除上清液，得沉淀，向沉淀中加入重悬液，混匀，然后再加入分离液，离心，取云雾层，向云雾层中加入重悬液，混匀，离心，得单个核细胞，向单个核细胞中加入重悬液，得细胞重悬液，细胞重悬液中单个核细胞密度为1-2×10⁸个/mL；

(2)向细胞重悬液中加入CD34⁺抗体，混匀，室温下孵育10-20min，然后加入CD34⁺免疫磁珠，混匀，室温下孵育10-20min，用新洗涤液洗涤后置于磁场中，静置3-5min后弃去上清液，得造血干细胞CD34⁺细胞；其中，CD34⁺抗体加入量为80-100μL/mL，CD34⁺免疫磁珠加入量为40-60μL/mL细胞重悬液；

(3)将造血干细胞CD34⁺细胞接种于胎盘血造血干细胞培养基中，使造血干细胞CD34⁺细胞密度为1-3×10⁵个/mL，置于37℃，5％CO₂饱和湿度培养箱中培养5-7天，收获细胞。