[发明专利]奶牛乳房炎致病菌三联表位基因与石斑鱼c型溶菌酶基因重组腺病毒的构建方法和应用

权利要求书

1.一种共表达奶牛乳房炎致病菌三联表位基因TRE与石斑鱼c型溶菌酶基因cLYZ的重组腺病毒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)从NCBI上搜索备选蛋白的氨基酸序列，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的ClfA与EbpS，登录号分别为EFM05894.1和EFM06457.1；大肠杆菌的(Escherichia coli)OmpC和OmpA，登录号为AIL15476.1和ELV73478.1；链球菌(Streptococcus)的SIP和PGK，登录号为AEL21614.1和AKU04271.1；通过ABCpred方案和BepiPred方案预测上述六种特异性蛋白的B细胞表位，选择在ABCpred方案中评分较高且BepiPred方案中共有的2个表位序列作为B细胞表位的预测结果；利用MHC-I类分子结合肽在线程序预测细胞毒性T细胞CTL表位，综合HLA-A2、HLA-A*0201、HLA-A*0202、HLA-A*0203、HLA-A*0205五种预测类型，选择预测结果中共有的1个表位序列作为CTL表位预测的结果；采用MHC-II类分子结合肽在线程序预测辅助性T细胞Th表位，选择DRB1-0101、DRB1-0102和DRB1-0301三种预测类型，综合三种方案选择共有的1个方案作为Th表位预测的结果；分别预测获得每种特异性蛋白的2个优势B细胞表位，1个优势CTL细胞表位和1个优势Th细胞表位，将所得优势表位使用连接肽进行连接获得TRE的氨基酸序列，并使用DNAStar软件Protean功能对其进行抗原性分析；

2)GeneBank上得到cLYZ序列，登录号为JQ287658.1，并进行哺乳动物细胞偏好性密码子优化；在所获得的TRE基因序列SEQ ID NO.7与优化后的cLYZ序列SEQ ID NO.9间插入T2A自剪切肽序列SEQ ID NO.8，进行合成，得到含有目的基因片段的质粒pMD-TRE-T2A-cLYZ；

3)采用AdMax腺病毒包装系统，将获得的目的基因从质粒pMD-TRE-T2A-cLYZ亚克隆到腺病毒穿梭载体质粒pDC315-MCS-EGFP上，获得重组穿梭载体pDC315-TRE-T2A-cLYZ-EGFP；

4)将重组穿梭载体pDC315-TRE-T2A-cLYZ-EGFP与腺病毒大骨架质粒pBHGloxE1,3Cre共转染HEK293细胞，同源重组获得重组腺病毒Ad-TRE-T2A-cLYZ-EGFP；

其中TRE基因和cLYZ基因亚克隆步骤：从合成并连接至pMD-19T载体上的pMD-TRE、pMD-cLYZ、pMD-TRE-T2A-cLYZ质粒中分别扩增出TRE序列SEQ ID NO.7、T2A序列SEQ ID NO.8、cLYZ序列SEQ ID NO.9；所述的TRE序列SEQ ID NO.7、T2A序列SEQ ID NO.8、cLYZ序列SEQID NO.9的扩增包括：以TRE-F SEQ ID NO.1和TRE-R SEQ ID NO.2为引物，以pMD-TRE的总DNA为模板，PCR扩增获得TRE基因SEQ ID NO.7；以T2A-F SEQ ID NO.3和T2A-R SEQ IDNO.4为引物，以pMD-TRE-T2A-cLYZ的总DNA为模板，PCR获得T2A基因SEQ ID NO.8；以cLYZ-FSEQ ID NO.5和cLYZ-R SEQ ID NO.6为引物，以pMD-cLYZ的总DNA为模板，PCR获得cLYZ SEQID NO.9；将其PCR扩增产物分别依次使用T₄连接酶过夜连接至穿梭载体pDC315-MCS-EGFP上，获得重组穿梭载体pDC315-TRE-EGFP、pDC315-cLYZ-EGFP、pDC315-TRE-T2A-cLYZ-EGFP。

2.如权利要求1所述的构建方法得到的共表达奶牛乳房炎致病菌三联表位基因TRE与石斑鱼c型溶菌酶基因cLYZ的重组腺病毒。

3.如权利要求1所述的构建方法制备的重组腺病毒在制备预防奶牛乳房炎的生物制品中的应用。