[发明专利]一株高产耐热植酸酶的毕赤酵母工程菌

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株高产耐热植酸酶的毕赤酵母工程菌。本发明通过PCR获得来自枯草芽孢杆菌突变菌的耐热植酸酶突变基因A‑2，并将A‑2构建到pPIC9质粒上，得到重组质粒pPIC9‑A‑2，并转化到毕赤酵母GS115，筛选得到高表达耐热植酸酶的重组菌，所表达的耐热植酸酶在80℃保温处理30min，相对活性仍剩余75％左右，90℃处理30min，酶活仍存留25％以上，耐热性良好，可以广泛用于食品、饲料等行业。

技术领域：

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一株高产耐热植酸酶的毕赤酵母工程菌。

背景技术：

磷是动物机体必须的矿物元素，植物组织中的磷大部分是以植酸(肌醇六磷酸)或植酸盐的形式存在，肌醇六磷酸分子可以螯合金属离子，以螯合物的形式存在，其溶解度很低，作用相当于抗营养因子，很难被单胃动物吸收，未被充分利用的磷，通过动物排泄物进入水体最终导致水体富营养化。

植酸酶是催化植酸及其盐类水解为肌醇与磷酸盐的一类酶的总称，在动物饲料中添加植酸酶，可以提高饲料中磷的利用率，减少磷的排出对环境的污染。1996年FDA确认植酸酶在食品中应用是安全的，可在动物饲料中使用，植酸酶已成为第三大饲用酶。可以通过微生物来大量合成植酸酶，添加到饲料中供动物体利用，以解决单胃动物缺乏能够利用植酸盐的植酸酶的问题，但是饲料加工过程中的热处理要求植酸酶有一定耐热性。而目前还面临植酸酶高昂生产成本、低植酸酶产率以及耐热性不足的问题。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种耐热性提高的植酸酶突变体及其毕赤酵母工程菌菌株。所述植酸酶突变体来自一株经紫外诱变获得的枯草芽孢杆菌BS2，将植酸酶突变体编码基因A-2从BS2中克隆并构建重组质粒后，在毕赤酵母GS115中进行表达，从而获得毕赤酵母工程菌菌株。

在本发明中采用如下定义：

1.氨基酸和DNA核酸序列的命名法

使用氨基酸残基的公认IUPAC命名法，用三字母代码形式。DNA核酸序列采用公认IUPAC命名法。

2.植酸酶突变体的标识

采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示突变体中突变的氨基酸。如Gln166Asn，表示位置166的氨基酸由野生型的Gln替换成Asn，位置的编号对应于SEQ IDNo.2中野生型植酸酶的氨基酸序列编号；同样采用“原始碱基位置替换的碱基”来表示突变体中突变的碱基，位置的编号对应于SEQ ID No.1中野生型植酸酶的核苷酸序列编号。

在本发明中，A-1表示野生型植酸酶的编码基因，A-2表示植酸酶突变体的编码基因，信息如下表。

所述植酸酶突变体的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.4所示；

所述植酸酶突变编码基因A-2的核苷酸序列为SEQ ID No.3所示；

用于表达所述植酸酶的表达载体为pPIC9，用于所述表达载体转化的微生物宿主细胞为毕赤酵母GS115；

所述毕赤酵母工程菌是将植酸酶突变编码基因A-2连接表达载体pPIC9，并在毕赤酵母GS115中表达所得；

本发明还提供上述植酸酶突变体在饲料领域的应用。

本发明的实验步骤具体如下：

1、将植酸酶突变体的编码基因A-2进行酶切，连接至表达载体pPIC9，得到重组载体；

2、将重组载体转化入毕赤酵母GS115中，得到植酸酶突变体的生产菌株GS115/pPIC 9-A-2；

3、以GS115/pPIC 9-A-2为生产菌株发酵生产植酸酶。