[发明专利]一种通过干扰黄萎病菌VdRGS1基因表达显著提高棉花对黄萎病抗性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一个黄萎病菌VdRGS1基因及通过干扰VdRGS1基因表达显著提高棉花对黄萎病抗性的方法。黄萎病菌Vd8和V991是两种侵染棉花的强致病力菌株，导致棉花黄萎病表型。RGS是G蛋白信号通路中G蛋白α亚基的负调控因子，利用农杆菌介导的方法将棉花黄萎病菌Vd8中的VdRGS1基因敲除和互补，获得VdRGS1敲除和回补突变体。功能和表型分析表明VdRGS1调控黄萎病菌致病性、微菌核形成、孢子及菌丝的生长等，在黄萎病菌侵染寄主时发挥重要作用。通过创制表达绿色荧光蛋白(GFP)的转基因V991黄萎病菌，验证了基于病毒诱导的基因沉默技术(VIGS)能够实现宿主诱导基因沉默(HIGS)。将表达GFP的黄萎病菌接种棉花后，通过VIGS技术可在棉花中高效沉默该转基因菌中的GFP基因，表明基于VIGS技术能够成功地在棉花中沉默入侵的黄萎病菌基因。利用以VIGS为基础的HIGS技术，在棉花中沉默黄萎病菌VdRGS1，显著提高了棉花对黄萎病菌的抗性。

背景技术

棉花(Gossypium spp.)作为全球最重要的经济作物之一，其产量和纤维品质严重受到黄萎病菌(Verticillium dahliae)的危害。棉花一旦感染黄萎病，轻则减产重则绝收，因此黄萎病被认为是棉花的“癌症”。据联合国粮农组织不完全统计，由于病害而造成的棉花减产可高达24％。我国每年因黄萎病害造成棉花产量损失达几十亿(Jian et al.,2003；Xu et al.,2012)。黄萎病菌是一种世界性毁灭性的植物病害，可危害660多种植物，造成寄主植物的萎蔫进而死亡，因此防治黄萎病刻不容缓(Bhat and Subbarao,1999)。

黄萎病菌是一种真菌病原菌，主要存在两类，一种是大丽轮枝菌Verticillium dahliae Kleb)，另一种是黑白轮枝菌(Verticillium alboatrum)，两种都是半知菌亚门(Deuteromycotina)中淡色孢科(Moniliaceae)，轮枝菌属(Verticillium)。目前主要危害我国棉花的黄萎病菌一般被认为是大丽轮枝菌(张绪振等,1981)。黄萎病菌开始生长的菌丝体呈无色，之后会逐渐变为橄榄褐色，膨胀状，其中菌丝芽殖变为微菌核，逆境条件下微菌核的形成会提前。黄萎病之所以难以防治，除了其强致病力外，更重要的是病菌以微菌核形式可以在土壤或秸秆中存活数十年，只要适宜的温度和湿度，就会立即打破休眠，从病菌孢子萌发成菌丝体，执行循环侵染。由于黄萎病菌的存活周期长，具有较强的适应性和抗逆性，所以黄萎病菌的防御和治理工作进展缓慢，化学和物理防治措施均未取得较理想的效果。