[发明专利]一种基于光学显微镜的抗坏血酸浓度在线传感分析方法以及辅助显色剂

说明书

本发明为一种基于光学显微镜的抗坏血酸浓度在线传感分析方法以及辅助显色剂，涉及一种用于辅助光学显微镜在线传感分析抗坏血酸浓度的显色剂，所述显色剂为液态显色剂，由包括羟基氧化钴和3,3',5,5'‑四甲基联苯胺的原料混合而成。本发明同时提供了一种基于光学显微镜的抗坏血酸浓度在线传感分析方法，该方法利用显微镜拍摄透明毛细管中显色剂与不同浓度抗坏血酸混合后的照片，通过软件处理将图像信号转化为数字信号，数字信号与抗坏血酸浓度呈现一定线性关系，从而实现对抗坏血酸的浓度检测。本发明提供的显色剂原料易得，制备简便，可以快速、实时连续的分析抗坏血酸变化情况，具有应用于监测活体脑神经生理过程中抗坏血酸变化情况的能力，并对建立其它光学传感体系方法具有一定的指导意义。

技术领域

本发明属于纳米材料和分析化学领域，涉及一种抗坏血酸光学检测方法。

背景技术

抗坏血酸是一种可水溶的六碳糖酸，也是一种重要的神经调质，生理条件下有两个可解离的质子(pKa＝4.04,11.34)。其具有的给电子性质使其在细胞内成为著名的小分子抗氧化剂和自由基清除剂，且部分疾病与抗坏血酸的水平有密切联系。因此，开发一种实时监控生理病理过程中抗坏血酸变化情况的传感方法具有实际意义。

目前关于抗坏血酸的含量的测定已有众多利用电化学检测抗坏血酸的方法，如恒电位分析法、差分脉冲伏安法、循环伏安法等。此外主要还有高效液相色谱法(HPLC)、HPLC-电化学检测联用法、毛细管电泳法、紫外比色法及荧光光谱法等。已报道文献中可实现在线分析的，主要以电化学方法为主，少有报道光学在线体系。光学分析方法检测抗坏血酸具有检测范围大、快速、简便、误差小等优点。但同时存在检测限高、反应时间长，难以连续和操作麻烦等问题。

目前已报道的光学在线体系中较为突出的一个工作是，赵美萍等结合显微镜拍照功能，及利用纳米金交联HS-PEG-COOH及带有荧光基团的GSH-FITC的纳米探针实现了对S^2-离子及大鼠脑内H₂S的实时在线检测。在其工作中，设计了一种微流控芯片来连续混合探针、S^2-离子样品/大鼠脑透析液及石蜡油，混合后引流至显微镜下的石英毛细管中拍照，并处理图像以得到荧光强度值。该工作虽可灵敏检测生理活性物质，但其基于荧光发光原理，对实验中环境光要求较多，且还未有更简单的、基于可见光吸收的光学在线传感体系的报道。

发明内容

为了克服上述技术缺陷，本发明提供一种基于光学显微镜的抗坏血酸浓度在线传感分析方法。本发明提供的显色剂以及方法可连续、快速、简单、灵敏地检测抗坏血酸。

本发明首先提供了一种用于辅助光学显微镜在线传感分析抗坏血酸浓度的显色剂，所述显色剂为液态显色剂，由包括羟基氧化钴和3,3',5,5'-四甲基联苯胺的原料混合而成。

由于羟基氧化钴和3,3',5,5'-四甲基联苯胺混合后，原本呈现无色的3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液被羟基氧化钴氧化，氧化态的3,3',5,5'-四甲基联苯胺呈现蓝色，溶液体系呈现蓝色；当溶液体系中通入抗坏血酸时，蓝色的氧化态3,3',5,5'-四甲基联苯胺被抗坏血酸还原为无色的还原态3,3',5,5'-四甲基联苯胺，溶液体系变为无色。在此过程中溶液体系的光强度值会发生变化，并可被光学显微镜捕捉、拍摄。本发明依据上述反应以及颜色的变化实现对抗坏血酸的检测。

为了提高检测的精确度，本发明优选在制备所述显色剂时，羟基氧化钴和3,3',5,5'-四甲基联苯胺的摩尔用量比为(1～1)：(3～1)。

为了能准确检验1～50μM浓度范围内的抗坏血酸，本发明优选所述显色剂由浓度35～45μg/mL的羟基氧化钴混悬液与浓度1.5～2.5mM的3,3',5,5'-四甲基联苯胺水溶液按体积比(1～2)：(1～2)混合而成，更优选地，所述显色剂由浓度40μg/mL的羟基氧化钴混悬液与浓度2.0mM的3,3',5,5'-四甲基联苯胺水溶液按体积比1:1混合而成。