[发明专利]三倍体湘云鲫尾鳍细胞系3nFC及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于鱼类发育领域，尤其涉及一种三倍体湘云鲫尾鳍细胞系3nFC及其构建方法和应用。

背景技术

湖南师范大学生命科学学院鱼类发育生物学研究室以红鲫(Carassius auratas red.Var,2n＝100)为母本、湘江野鲤(Cyprinus carpio,2n＝100)为父本进行杂交，子一代(F1)中发现部分可育后代。通过F1自交获得二倍体后代F2；将F2自交得到了F3。F3为雌雄均可育、染色体数目为200条的异源四倍体。该异源四倍体鲫鲤群体雌雄可育且能稳定的产生二倍体配子，使得四倍体特征能够连续稳定遗传。以异源四倍体鲫鲤为父本，二倍体日本白鲫为母本，通过倍间交配方法制备出染色体数目为150的三倍体湘云鲫(3n＝150)。三倍体湘云鲫的性腺根据其结构特征可被分成三种：卵巢型、精巢型和脂肪型；三倍体湘云鲫的三种性腺均不能产生可育的配子，繁殖和养殖实践也证明了其完全不育性。由于三倍体湘云鲫具有生长速度快、抗病性强、抗逆性强及完全不育的优点，已经在全国得到推广养殖，产生了显著的经济效益和社会效益。

改良三倍体湘云鲫(湘云鲫2号)是改良四倍体鲫鲤和改良三倍体湘云鲫进行交配产生的一种新型三倍体鲫鱼。与传统三倍体湘云鲫相比，改良三倍体鲫鱼不但保留了三倍体鱼生长速度快、不育等特点，而且在体形方面表现出明显的改良特征。

近年来对改良三倍体湘云鲫以及改良三倍体鲫鱼的水产养殖研究表明两种鱼都具有生长速度快，肉质好，抗逆性强等方面的优势，这为其在全国范围内推广奠定了坚实的基础。改良三倍体湘云鲫较其母本(改良二倍体红鲫)和父本(四倍体鲫鲤)具有更强的抗病能力，这已经在生产实践中得到了验证，但目前缺乏与抗病性能力相关的理论依据。因此建立合适的体外研究细胞系，并利用其深入探究三倍体鱼抗病能力强的生物学学机制是十分有意义的。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，针对目前研究三倍体鱼抗病机制缺乏合适的体外细胞系，而提供一种三倍体湘云鲫尾鳍细胞系3nFC及其构建方法和应用。

为解决上述问题，本发明一方面提供了一种三倍体湘云鲫尾鳍细胞系3nFC，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201732。

本发明另一方面提供了一种三倍体湘云鲫尾鳍细胞系3nFC的构建方法，主要包括以下步骤：

(1)从三倍体湘云鲫尾鳍进行取材，消毒漂洗后剪成尾鳍组织小块；

(2)将步骤(1)后得到的尾鳍组织小块用胎牛血清浸泡后，在DMEM培养基中进行原代培养；

(3)待步骤(2)后得到的细胞生长至形成单层后，加入胰酶进行消化，终止消化后进行传代培养。

上述的构建方法，优选的，所述构建方法具体包括以下步骤：

(1)用体积浓度为70％～75％的酒精对要取材的三倍体湘云鲫尾鳍进行消毒后，剪取尾鳍组织，用70％～75％的酒精浸泡，再用磷酸缓冲液漂洗后剪成0.5～1mm²的尾鳍组织小块；

(2)将步骤(1)后得到的尾鳍组织小块用磷酸缓冲液清洗，进行离心，去上清，再用磷酸缓冲液重复清洗，加入尾鳍组织小块5～10倍体积的胎牛血清浸泡15～30min，进行离心，去上清后，将得到的尾鳍组织小块均匀接种于培养皿底部，25℃下倒置干贴0.5～2h，往培养皿中加入DMEM培养基，置于25℃且含体积5％CO₂的培养箱中培养；

(3)当细胞生长至形成单层后，去除培养皿中的培养基并加入磷酸缓冲液润洗细胞，去除磷酸缓冲液，加入质量浓度0.25％的胰酶消化，除去胰酶，加入DMEM培养基终止消化，用移液器轻轻吸打使细胞充分分离，以1：1.5～2的细胞数量比进行传代，然后仍置于培养箱中继续培养，待其再次长至单层后，依照上述方法再进行传代培养，将得到的三倍体湘云鲫尾鳍细胞系3nFC进行细胞冻存和细胞复苏。