[发明专利]一种浓度梯度rhIL-2依赖的iNKT细胞扩增方法及其应用

说明书

本发明公开了一种浓度梯度rhIL‑2依赖的iNKT细胞扩增方法及其应用。本方法包括(1)提取外周血单个核细胞PBMC；向步骤(1)提取的PBMC细胞中加入终浓度为100ng/mlα‑GalCer培养48小时；向步骤(2)培养细胞中以梯度的方式逐渐增加培养基中rhIL‑2浓度。本发明在培养第21天收获iNKT细胞，iNKT细胞数提高10万倍，其中90％以上为CD4－iNKT细胞，具有上调免疫反应和直接杀瘤作用。本发明的方法激活和扩增的iNKT细胞扩增效率更高，选择性地扩增Th1样iNKT细胞，加强了体外扩增iNKT细胞免疫增强、肿瘤免疫监控和杀伤的功能。

技术领域

本发明属于肿瘤细胞免疫治疗领域，更具体地，本发明涉及具有肿瘤杀伤效应的Th1样iNKT细胞快速大量扩增的方法和应用。

背景技术

恒定自然杀伤T(invariant nature killer T,iNKT)细胞是一类天然存在的介导先天性免疫和获得性免疫的免疫细胞,是T淋巴细胞中独特的亚群，具有类NK(naturekiller)细胞样对刺激迅速产生细胞因子和趋化因子来调节免疫反应的天然免疫功能，也通过T细胞受体(TCR)对抗原产生特异性的反应。不同于传统T淋巴细胞的TCR，iNKT细胞具有高度保守的TCRα链，人类的TCRα链由Vα24-Jα28部分组成，可与多种糖脂类抗原反应。此外，不同于传统的T细胞识别抗原提呈细胞(antigen presenting cell,APC)的I类或II类主要组织相容性复合体分子(major histocompatibility complex,MHCI or II)提呈抗原肽，iNKT细胞能特异性识别APC表面非经典MHC I类分子CDld提呈的糖脂类抗原。活化后的iNKT细胞分泌多种细胞因子，直接或间接参与不同的免疫应答。不同亚群或亚型的iNKT细胞具有不同的免疫调节功能。

iNKT细胞同时具有诱导免疫增强和免疫监控的功能。在抗原刺激下，iNKT细胞可以分泌一系列细胞因子，包括：干扰素-γ(interferon-gamma,IFN-γ)，白介素(IL)-2,4，10，13，17，21，22以及粒-单系集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)。

iNKT细胞通过CD1d-TCR复合物和CD40-CD40L相互作用特异性的诱导树突状细胞(Dendritic Cells,DC)成熟，并分泌IL-12。IL-12刺激NK、NKT细胞、及其他T细胞产生更多IFN-γ。这两种细胞因子一起显著的激活了下游效应细胞群如NK细胞、CD8⁺T细胞和γδT细胞。iNKT细胞的活化进一步促进DC上调CD70，CD80和CD86等共刺激分子的表达。而DC表达CD70是CD8⁺T细胞启动适应性免疫所必须的。活化的iNKT细胞分泌的IL-2诱导记忆性CD4⁺T辅助细胞增殖。CD4⁺T细胞在不同细胞因子的作用下分化为不同T辅助细胞亚群。iNKT细胞可以分泌Th1/促炎性(IFN-γ、TNF-α)或Th2/抗炎性(IL-4、10、13)细胞因子，这种级联增强的效应同时激发了天然免疫和获得性免疫，诱导杀伤MHC阳性的肿瘤细胞。对MHC阴性的肿瘤细胞，iNKT细胞经α-GalCer等糖脂抗原激活后表现出NK细胞样MHC非依赖性细胞毒活性，通过诱导表达穿孔素/颗粒酶FasL/Fas或者TNF相关的凋亡诱导配体(TRAIL)等直接杀伤。对CD1d⁺肿瘤细胞(如急性T淋巴细胞性白血病、单核细胞性白血病和其它血液恶性肿瘤)，可以直接识别并表现有效的靶细胞杀伤效应。