[发明专利]一种脂质体/凝胶复合型基因活化支架的制备方法

说明书

本发明涉及一种脂质体/凝胶复合型基因活化支架的制备方法，属于生物医学技术领域；本发明用TAT修饰脂质体作为高效的基因转染载体，将其包载于MMPs敏感肽交联的透明质酸凝胶中，从而构建一种内部包载脂质体的MMPs敏感型的基因活化支架；细胞在迁移和增殖的过程中分泌MMPs，使凝胶降解，一方面为细胞自身的迁移和增殖创造空间，避免凝胶的网状结构成为细胞迁移和增殖的物理屏障，另一方面释放出TAT‑脂质体，对周围细胞进行高效的原位转染，从而表达并分泌生长因子，促进组织修复与再生。

技术领域

本发明涉及一种组织工程支架的制备方法，尤其涉及一种基质金属蛋白酶敏感的脂质体/凝胶复合型基因活化支架的制备方法，属于生物医学技术领域。

背景技术

随着医学技术的迅猛发展，利用组织工程技术进行缺损组织和器官的修复与再生已成为一种极具潜力的治疗手段，生长因子是组织工程中应用的重要的细胞营养物质，具有诱导和刺激细胞增殖、维持细胞存活等多方面的生物功能。然而，生长因子多为蛋白类药物，其半衰期比较短，在体内容易失去生物活性，只能在短期内产生效果，此外，生长因子的价格昂贵，治疗成本高昂。

近年来，基因治疗技术的发展及其在组织工程领域的应用为这些问题的解决提供了新的策略。目前，关于GAM的研究热点主要集中于仿生支架的设计以及如何实现高效的DNA转染这两个方面。将编码有生长因子并具有转染能力的DNA融合于生物可降解材料中构建含DNA的生物支架，即基因活化支架(gene-activated matrix，GAM)。将GAM直接植入到组织缺损区，可在植入部位释放DNA并转染附近的细胞。一旦转染成功，细胞将成为生物反应器，持续表达并分泌基因所编码的生长因子，达到对细胞分化和组织再生调控的目的。尽管目前使用的支架材料通常为生物可降解的，但支架的降解速率仍不能与细胞的迁移和增殖同步，限制了细胞在凝胶内的迁移和增殖，同时也使得包裹于支架内的DNA不能有效释放出来转染周围细胞。此外，目前使用的基因转染载体通常是阳离子聚合物，如聚乙烯亚胺PEI等，但其转染效率较低，进一步限制了GAM的研究与应用。

凝胶是组织工程中常用的支架形式，其交联网络的多孔结构利于细胞的迁移以及活性物质的传递。但是，凝胶支架在为细胞提供生长微环境的同时，也成为了细胞迁移和增殖的物理屏障。尽管组织工程中所用的凝胶材料通常都是生物可降解的，如壳聚糖、海藻酸钠、透明质酸等，但是在凝胶制备过程中所用的人工合成的聚合物交联剂往往会影响凝胶的生物降解性能，使凝胶的降解速率不能与细胞的迁移和增殖同步，限制了细胞在凝胶内的迁移和增殖。

GAM需要将DNA复合物融合到支架材料中，因而，支架对DNA复合物的负载与有效释放是至关重要的。利用凝胶包载基因实现基因的局部用药已有广泛研究。裸DNA已被成功地包载到胶原、普朗尼克/透明质酸、聚乙二醇、海藻酸钠等材料制备的凝胶中，植入机体后实现了基因原位转染和体内组织修复，但是裸DNA较低的转染效率以及较慢的释放速率限制了它们的应用。

基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)属于细胞内的蛋白水解酶家族，在组织修复过程中，细胞能够分泌MMPs，它几乎能降解细胞外基质中的各种蛋白成分，从而为细胞的迁移与增殖提供空间。细胞穿膜肽TAT具有高效的入胞能力，能够迅速破坏内吞体膜，逃逸溶酶体。TAT已经成功携带多种生物活性物质及载体，包括蛋白质、DNA、多肽、纳米粒、脂质体等进行细胞内的传输，是一种新型而高效的药物递送工具。利用TAT修饰聚阳离子脂质体可以实现高效的基因转染。

本发明用TAT修饰脂质体作为高效的基因转染载体，将其包载于MMPs敏感肽(HS-MMP-SH)交联的透明质酸凝胶中，从而构建一种内部包载脂质体的MMPs敏感型的基因活化支架。细胞在迁移和增殖的过程中分泌MMPs，使凝胶降解，一方面为细胞自身的迁移和增殖创造空间，避免凝胶的网状结构成为细胞迁移和增殖的物理屏障，另一方面释放出TAT-脂质体，对周围细胞进行高效的原位转染，从而表达并分泌生长因子，促进组织修复与再生。

发明内容