[发明专利]一种表达重组菌丝霉素的毕赤酵母

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术和基因工程技术领域，特别涉及一种表达重组菌丝霉素的毕赤酵母。

背景技术

菌丝霉素（Plectasin）是由丹麦诺维信公司从腐生子囊菌假黑盘菌（Pseudoplectania nigrella）中分离得到的首例真菌防御素（专利WO 2003044049 A1）。菌丝霉素基因的完整开放阅读框编码一个长为95个氨基酸的多肽，共由3部分组成。信号肽序列（1～23位氨基酸）、前肽（24～55位氨基酸）和C-末端成熟肽（56～95位氨基酸）。成熟的菌丝霉素由40个氨基酸残基组成，其二级结构属于α-β模型，由一个α-螺旋和两个反平行的β-折叠组成，其中包含三个二硫键(Cys4-Cys30，Cys15-Cys37，Cys19-Cys39)，其净电荷数为+1～+3。NZ2114突变体是诺维信公司对菌丝霉素基因通过高通量突变筛选获得的含3个氨基酸突变的变异体。与菌丝霉素相比，NZ2114突变体对金黄色葡萄球菌的抑制作用显著提高。

菌丝霉素对革兰氏阳性细菌具有明显杀伤作用，包括：链球菌属，葡萄球菌属，肠球菌属，棒状杆菌属和杆状菌属。尤其值得注意的是，菌丝霉素对肺炎链球菌的杀菌效果与万古霉素和青霉素的杀菌效果相当。菌丝霉素具有良好的盐离子耐受能力、pH稳定性和热稳定性。同时，菌丝霉素无细胞毒性、无溶血性及脑脊液渗透性好，是治疗革兰氏阳性细菌引起的疾病的潜在药物，具有广阔应用前景。

菌丝霉素的生产方式主要有三种：提取、化学合成和生物合成。腐生子囊菌中的菌丝霉素含量非常少，因此通过提取方式获得菌丝霉素是非常不经济的。化学合成得到的菌丝霉素，由于无法形成二硫键，因此菌丝霉素的空间结构不正确，抑菌活性大幅减少。还需要后续操作重新形成二硫键，步骤繁琐，价格昂贵，不适合大规模生产。生物合成主要通过基因工程手段构建工程菌株异源表达菌丝霉素，主要有原核表达和真核表达系统。中国专利授权号CN103374579B提供了一种菌丝霉素和硫氧还蛋白融合表达的大肠杆菌工程菌，摇瓶产量为0.124g/L融合蛋白。中国专利授权号CN104232712B提供了一种分泌表达菌丝霉素的酿酒酵母工程菌，摇瓶产量为0.143g/L总蛋白。中国专利申请号201611052836.1提供了一种菌丝霉素和SUMO融合表达的枯草芽孢杆菌工程菌，摇瓶产量为5.5mg/L菌丝霉素。上述表达系统的菌丝霉素产量都非常低。

毕赤酵母表达系统是最常用的蛋白表达系统之一，已有上千种蛋白在毕赤酵母中成功表达，并有多种蛋白实现工业化生产。中国专利授权号CN103045636B提供了一种分泌表达菌丝霉素的毕赤酵母工程菌，发酵罐产量为1.3g/L菌丝霉素。该专利通过单拷贝菌丝霉素表达载体pPICZαA-NZ2114整合至X-33毕赤酵母基因组，再通过博来霉素抗生素筛选高拷贝菌株。由于在一次转化过程中表达载体在基因组中发生多次整合的概率极低，导致筛选菌株的基因拷贝数不高，所以通过该方法获得的工程菌的菌丝霉素表达量低，筛选工作量大。同时，该表达载体是以AOX1启动子作为整合为点，因此这些多拷贝菌株的载体整合片段都是相互邻近的，在传代过程中会由于同源重组的原因导致基因拷贝数逐渐减少，引起菌株不稳定。

可见，现有技术还有待改进和提高。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种重组菌丝霉素的毕赤酵母，旨在解决现有技术中通过毕赤酵母表达菌丝霉素的表达量低，筛选工作量大，而且菌株在传代过程中基因拷贝数逐渐减少，菌株不稳定的问题。

为了达到上述目的，本发明采取了以下技术方案：

一种表达重组菌丝霉素的毕赤酵母,其中，该毕赤酵母分别经过三种不同菌丝霉素表达载体转化，并且每次转化得到的菌株选用不同的抗生素高拷贝筛选；

其中，所述菌丝霉素表达载体依次为：pTRP-NZ2114、pPIC9K-NZ2114、pPIC6αA-NZ2114。

所述的表达重组菌丝霉素的毕赤酵母，其中，所述的毕赤酵母为毕赤酵母X-33基因工程菌，所述菌丝霉素包括如SEQ ID No.1所示的DNA序列。

所述的表达重组菌丝霉素的毕赤酵母，其中，高拷贝筛选所述的菌丝霉素表达载体pTRP-NZ2114转化感受态细胞后的筛选抗生素为0.25～4mg/mL的博来霉素。

所述的表达重组菌丝霉素的毕赤酵母，其中，所述菌丝霉素表达载体pTRP-NZ2114转化的感受态细胞包括毕赤酵母X-33、毕赤酵母GS115、毕赤酵母SMD1168。