[发明专利]用于基因递送的壳聚糖纳米粒微泡复合物及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种超声介导基因递送的载体，具体涉及一种用于基因递送的壳聚糖纳米粒微泡复合物及其制备方法。

背景技术

超声微泡(又称超声造影剂)的外壳一般由脂质、白蛋白、多聚物以及表面活性剂等成分组成，内核气体则为空气或全氟丙烷等惰性气体，其结构特点决定了其具有携载基因或药物的能力，因而被视为一种较理想的基因或药物载体。目前常用的超声微泡主要有SonoVue、Optison、Definity等，已有大量研究应用它们联合超声介导体内外基因转染的报道。

为了进一步提高基因治疗效果，需要超声微泡能够携载大量的目的基因，同时在体内输送过程中不被酶降解破坏，甚至还具有靶向特异结合的能力，这就需要寻找新型材料制备功能更强大的载基因微泡。载基因微泡的制备主要考虑以下几个方面：泡膜成分的挑选，其最好有一定的柔韧性和强硬度，这样才能保证制备的微泡在体内外都能稳定保存及输送；核心气体的挑选，常用的氟碳气体因为其弥散作用较慢，并且是一种安全的惰性气体而作为首选使用，同时其成像效果满意；靶向性和稳定性的问题，如果对已经制备好的载基因微泡进行表面修饰(如连接特定的抗体或配体等)，这样就可以实现目的基因的靶向治疗作用。

从振荡生理盐水产生无泡膜包裹的超声造影剂到目前的靶向多功能超声造影剂，其结构越来越复杂，功能越来越多，制备流程也越来越复杂困难。目前，超声微泡制备的常见方法主要有中和法、机械振荡法、冷冻干燥法、声振空化法、乳化法等。机械振荡的方法可弥补传统的声振法对基因损伤的缺点，同时基因可被包裹或镶嵌于磷脂双分子层上而不是简单地吸附连接，因而可以显著提高微泡的基因包裹能力。在制备过程中，需要根据不同的材料及功能要求选择合适的制备方法，可以单独使用一种方法，也可以多种方法联合使用。

随着制备工艺的不断完善和改良，超声微泡在疾病诊疗过程中发挥越来越重要的作用，因而制备高效、靶向特异、安全的新型微泡已成为该研究领域的关键问题。根据泡膜材料及携载物质的不同，基因与微泡的结合方式有几种：静电作用，治疗基因以非共价方式结合吸附于微泡表面；目的基因借助共价键吸附于微泡表面；将基因融合到微泡的外壳成分中(作为外壳的组成材料)，在实现基因携载作用的同时可以有利于提高微泡的稳定性；目的基因被压缩包被在微泡的内部，此种方法可以避免在体内循环时目的基因被冲刷脱掉或者被酶降解破坏等问题；首先目的基因被包裹在脂质体或纳米粒中，接着以非共价或共价方式(如生物素-亲和素作用系统、静电吸附等)将包裹基因的纳米粒连接到已经制备好的超声微泡上。通过与阳离子微泡的电荷相互作用或在制备时将DNA与微泡成分混合，将质粒DNA黏附到微泡膜上，带正电荷基团与带负电荷的质粒DNA间发生静电相互作用，使DNA受到保护从而增强基因转染效率。

壳聚糖作为一种天然的阳离子聚合物，具有低毒、低免疫原性、良好生物相容性、价格低廉、易降解等优点，被广泛应用于生物医药领域。在酸性环境下，壳聚糖上的氨基质子化可带上正电荷，与带负电的基因通过静电作用形成复合物。而在生理条件下(pH＝7.40)，壳聚糖不能质子化，壳聚糖/基因复合物能稳定地存在于生理环境，在一定程度上保护基因不被细胞环境中溶酶体、核酸酶等物质降解，因此壳聚糖被认为是一种理想的非病毒载体。然而目前，并没有关于壳聚糖/基因复合物在体内转染实验方面的报道。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于基因递送的壳聚糖纳米粒微泡复合物及其制备方法，既弥补了脂质微泡作为基因释放载体的不足，又解决了壳聚糖纳米粒靶向性不强的缺点。

本发明的目的通过以下技术方案实现：用于基因递送的壳聚糖纳米粒微泡复合物，包括壳聚糖纳米粒和脂质微泡，所述壳聚糖纳米粒与脂质微泡之间通过生物素和亲和素的作用形成复合物。

优选的，所述的用于基因递送的壳聚糖纳米粒微泡复合物，所述壳聚糖纳米粒包括壳聚糖和基因，所述壳聚糖为生物素化壳聚糖，生物素化壳聚糖与基因制备成壳聚糖纳米粒后再与脂质微泡作用。

优选的，所述的用于基因递送的壳聚糖纳米粒微泡复合物，所述脂质微泡为生物素化脂质微泡，壳聚糖纳米粒与生物素化脂质微泡在亲和素的作用下形成复合物。

用于基因递送的壳聚糖纳米粒微泡复合物的制备方法，包括如下步骤：

第一步，壳聚糖纳米粒的合成：在45℃下，将生物素化壳聚糖溶解在醋酸溶液中，过滤后，加入适量的基因溶液，涡旋1min后静置，备用即可；