[发明专利]利用乙酸生产乙醇酸的基因工程菌及其构建方法和应用

权利要求书

1.制备用于生产乙醇酸的工程菌的方法，包括如下步骤：提高受体菌中乙酰辅酶A合成酶、磷酸转乙酰酶、乙酸激酶、柠檬酸合酶、异柠檬酸裂解酶、异柠檬酸脱氢酶激酶、乙醛酸还原酶的表达和/或活性，且降低所述受体菌中苹果酸合酶、乙醇酸氧化酶和异柠檬酸裂解酶阻遏蛋白的表达和/或活性，从而获得所述用于生产乙醇酸的工程菌；所述受体菌为能够以乙酸作为碳源生长的菌；

所述受体菌为大肠杆菌；

所述“提高受体菌中乙酰辅酶A合成酶、磷酸转乙酰酶、乙酸激酶、柠檬酸合酶、异柠檬酸裂解酶、异柠檬酸脱氢酶激酶、乙醛酸还原酶的表达和/或活性”是通过向所述受体菌中导入乙酰辅酶A合成酶的编码基因、磷酸转乙酰酶的编码基因、乙酸激酶的编码基因、柠檬酸合酶的编码基因、异柠檬酸裂解酶的编码基因、异柠檬酸脱氢酶激酶的编码基因和乙醛酸还原酶的编码基因来实现的；

所述“降低所述受体菌中苹果酸合酶、乙醇酸氧化酶和异柠檬酸裂解酶阻遏蛋白的表达和/或活性”是通过敲除所述受体菌中苹果酸合酶的编码基因、乙醇酸氧化酶的编码基因和异柠檬酸裂解酶阻遏蛋白的编码基因来实现的；

所述乙酰辅酶A合成酶的编码基因的核苷酸序列为序列表中序列2的第70-2028位；

所述磷酸转乙酰酶的编码基因的核苷酸序列为序列表中序列3的第1347-3491位；

所述乙酸激酶的编码基因的核苷酸序列为序列表中序列3的第70-1272位；

所述柠檬酸合酶的编码基因的核苷酸序列为序列表中序列1的第70-1353位；

所述异柠檬酸裂解酶的编码基因的核苷酸序列为序列表中序列5的第70-1374位；

所述异柠檬酸脱氢酶激酶的编码基因的核苷酸序列为序列表中序列5的第1557-3293位；

所述乙醛酸还原酶的编码基因的核苷酸序列为序列表中序列4的第70-1008位；

所述苹果酸合酶为苹果酸合酶1和/或苹果酸合酶2；所述苹果酸合酶1的编码基因的核苷酸序列为序列表中序列21；所述苹果酸合酶2的编码基因的核苷酸序列为序列表中序列22；

所述乙醇酸氧化酶的编码基因的核苷酸序列为序列表中序列23；

所述异柠檬酸裂解酶阻遏蛋白的编码基因的核苷酸序列为序列表中序列24；

所述乙酰辅酶A合成酶的编码基因是通过序列表中序列2所示的DNA分子导入所述受体菌中的；

所述磷酸转乙酰酶的编码基因和所述乙酸激酶的编码基因是通过序列表中序列3所示的DNA分子导入所述受体菌中的；

所述柠檬酸合酶的编码基因是通过序列表中序列1所示的DNA分子导入所述受体菌中的；

所述异柠檬酸裂解酶的编码基因和所述异柠檬酸脱氢酶激酶的编码基因是通过序列表中序列5所示的DNA分子导入所述受体菌中的；

所述乙醛酸还原酶的编码基因是通过序列表中序列4所示的DNA分子导入所述受体菌中的；

所述苹果酸合酶1的编码基因是通过λ-red同源重组的方式进行敲除的，其中同源重组片段的核苷酸序列为序列表中序列6；

所述苹果酸合酶2的编码基因是通过λ-red同源重组的方式进行敲除的，其中同源重组片段的核苷酸序列为序列表中序列7；

所述乙醇酸氧化酶的编码基因是通过λ-red同源重组的方式进行敲除的，其中同源重组片段的核苷酸序列为序列表中序列8；

所述异柠檬酸裂解酶阻遏蛋白的编码基因是通过λ-red同源重组的方式进行敲除的，其中同源重组片段的核苷酸序列为序列表中序列9。

2.由权利要求1所述的方法制备得到的用于生产乙醇酸的工程菌。

3.权利要求2中所述工程菌在以乙酸作为底物生产乙醇酸中的应用。

4.一种生产乙醇酸的方法，包括如下步骤：以乙酸作为碳源，发酵培养权利要求2中所述工程菌，收集发酵产物，从中获得乙醇酸。