[发明专利]一种双层析法制备人纤维蛋白原的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，涉及一种双层析法制备人纤维蛋白原的方法。

背景技术

人纤维蛋白原(fibrinogen，Fg)，即凝血因子Ⅰ，是血浆中含量最高的凝血因子，也是凝血系统中的“中心”蛋白质。人纤维蛋白原是一种由肝脏合成的，是纤维蛋白的前体。分子量340，000，半衰期4～6日。血浆中参考值2～4克/升。纤维蛋白原由α、β、γ三对不同多肽链所组成，多肽链间以二硫键相连。它与血浆凝固有关。在凝血酶作用下，α链与β链分别释放出A肽与B肽，生成纤维蛋白单体。主要应用于先天性人纤维蛋白原减少或缺乏症；获得性纤维蛋白原减少症，包括：严重肝脏损伤；肝硬化；弥散性血管内凝血；产后大出血和因大手术、外伤或内出血等引起的纤维蛋白原缺乏而造成的凝血障碍。是临床上用于大出血的必备急救药品之一。

人纤维蛋白原是已有国家标准的血液制品，收录于2015版《中国药典》三部中，该药在国内已临床使用多年，其工艺比较成熟。厂家主要有华兰生物、江西博雅等少数几家，绝大部分生产企业均采用从组分Ⅰ中经两次乙醇沉淀法提取，也有报道以甘氨酸沉淀法结合离子交换层析法或其他类似方法生产人纤维蛋白原，如同路生物以Q Sepharose fastflow凝胶吸附结合甘氨酸沉淀法从组分Ⅰ提取人纤维蛋白原，申请号201510992448.0。绿十字(中国)以DEAE-650结合甘氨酸沉淀从冷沉淀中提取人纤维蛋白原，申请号200910237204.6。未见报道利用双层析法制备人纤维蛋白原。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供一种高纯度、高收率、成品复溶时间短的双层析法制备人纤维蛋白原的方法，该方法采用离子交换层析结合肝素亲和层析，全程在常温环境生产，工艺流程短，产品纯度高，收率高，复溶时间短。

其具体技术方案为：

一种双层析法制备人纤维蛋白原的方法，包括以下步骤：

(1)组分Ⅰ沉淀溶解、过滤：组分Ⅰ沉淀用10～15倍溶解液，20～26℃水浴搅拌至溶解完全，板框过滤，收集滤液。所述溶解液为：每1000ml注射用水含枸橼酸钠10～15g，氯化钠8～12g，盐酸赖氨酸3～6g,肝素钠3000～5000IU，用1MHCl调pH6.7～7.0，温度20～26℃。

(2)S/D病毒灭活：按步骤(1)过滤液重量的1/10加入S/D溶液，使混合液中聚山梨酯80含量为1.0％，磷酸三丁酯含量为0.3％，缓慢升温至24.0～26.0℃，温度达到24.0℃并恒定后开始计时，恒温6小时。

(3)离子交换层析：将步骤(2)所得溶液用Q Sepharose Fast Flow离子交换层析柱吸附，收集流穿液，吸附结束后，用3～5倍柱体积溶解液洗涤层析柱，洗涤液并入流穿液。

(4)一次超滤浓缩：将步骤(3)所得流穿液超滤浓缩至组分Ⅰ重量的8～10倍，5～8倍透析液透析至蛋白浓度3.0％～3.5％(g/ml)，pH6.8～7.2。所述透析液为：1000ml注射用水中含枸橼酸钠8～12g，氯化钠3～6g，盐酸精氨酸30～36g，肝素钠500～1000IU，用0.5MNaOH调pH 6.8～7.2，温度20～26℃。

(5)肝素亲和层析：凝胶使用UniGel-DEAE凝胶，先用一次超滤液平衡层析柱，再将步骤(4)所得溶液上柱纯化，3～5倍柱体积一次超滤液洗涤，3～6倍柱体积洗脱液洗脱，收集洗脱液。所述洗脱液为：每1000ml注射用水中含枸橼酸钠10～20g，氯化钠55～100g，甘氨酸20～24g，用1M盐酸调整pH 6.8～7.2，液温20～26℃。

(6)二次超滤浓缩：将步骤(5)所得洗脱液超滤浓缩，5～8倍透析液透析至蛋白浓度≥2.5％g/ml。所述透析液为：1000ml注射用水中含枸橼酸钠8～12g，氯化钠3～6g，甘氨酸20～24g，用0.5MNaOH调整pH 6.8～7.2，温度20～26℃。

(7)检测配制：检测步骤(6)所得超滤液蛋白含量，用步骤(6)所述透析液稀释配制，使制品的蛋白含量为2.2～2.4％g/ml。

(8)分装冻干：将步骤(7)配制后溶液分装至50ml冻干玻璃瓶中，每瓶装25ml，然后冷冻干燥。

(9)轧盖及干热灭活：将步骤(8)冷冻干燥后制品轧盖，然后置99.5～100.5℃水浴中干热灭活30min。

进一步，步骤(1)中，板框过滤采用的滤板孔径为0.7μm～1.0μm。

与现有技术相比，本发明的有益效果：