[发明专利]一株基因工程菌乳酸乳球菌及其应用

说明书

本发明公开了一种基因工程菌乳酸乳球菌及其应用，该基因工程菌乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ9000/pNZ8048‑pdh，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC M 2017453；本发明基因工程菌经乳酸链球菌素诱导，使预苯酸脱氢酶基因(pdh)在乳酸乳球菌NZ9000中高效表达，可显著提高对羟基苯乳酸（OH‑PLA）产量，加强对食源性病原菌的抑制能力；实验证明，诱导后的基因工程菌发酵上清液，OH‑PLA产量是未诱导的1.74‑2.41倍，对食源性病原菌金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、尖孢镰刀菌和扩展青霉的抑制率分别为39%、51%、66%和60%。

技术领域

本发明涉及一种基因工程菌乳酸乳球菌及其应用，属于微生物基因工程领域。

背景技术

对羟基苯乳酸（OH-PLA），又称3-（4-羟基苯基）乳酸，是一种广泛存在自然界中的小分子天然有机酸；可以抑制多种病原菌的生长，被认为是一种新型生物防腐剂。OH-PLA稳定性好，熔点为106~110℃，亲水性比较大，能在食品体系中均匀扩散，在食品防腐领域显现巨大潜力。

对羟基苯乳酸广泛存在于各种传统发酵食品中，是传统发酵食品优势菌群---乳酸菌的一种主要代谢产物。乳酸菌是公认的食品级安全微生物，因其可以定居于人类肠道且有益于人体健康，经常作为益生菌应用于食品、保健品和药品等领域。从分类学上看，乳酸菌包含43个属，约373个种和亚种。植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）和乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）是乳酸菌两个常见种。

目前OH-PLA的生产方法主要有化学合成法和微生物发酵法。在微生物发酵法中，改变优化发酵底物和发酵条件以提高OH-PLA产量是研究的主流，而通过基因工程手段改变OH-PLA生物合成路径的研究只有一例。Koma等人（2012）通过在大肠杆菌（Escherichia coli）中导入乳酸脱氢酶基因，使发酵上清中的OH-PLA含量显著增加。

本发明利用基因工程手段，从植物乳杆菌L8（分离于豆豉---一种中国传统发酵食品）中克隆预苯酸脱氢酶基因（pdh），将该基因连接到表达质粒pNZ8048上，再转化至乳酸乳球菌NZ9000中，得到重组表达菌株NZ9000/pNZ8048-pdh，该基因工程菌经乳酸链球菌素（nisin）诱导，使pdh在乳酸乳球菌中高效表达，可提高OH-PLA产量，加强对食源性病原菌抑制性。因pdh来源和异源表达菌株均是食品级微生物以及OH-PLA自然存在于各种传统发酵食品中，所以本发明获得的OH-PLA是一种天然的、安全无毒的新型食品防腐剂，在食品防腐领域具有广阔的应用前景。经文献检索，未见与本发明相同的公开文献报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基因工程菌乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ9000/pNZ8048-pdh，该基因工程菌已于2017年8月28日保藏在中国典型培养物保藏中心；保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学；保藏号为CCTCC NO：M 2017453。

本发明利用PCR技术从食源性乳酸菌中扩增预苯酸脱氢酶基因（pdh），该基因与表达载体pNZ8048连接后，将得到的重组表达载体pNZ8048-pdh转入乳酸乳球菌NZ9000细胞内中，通过氯霉素抗性筛选获得pdh异源表达基因工程菌NZ9000/pNZ8048-pdh。