[发明专利]一种基于双水相液滴的细胞3D培养水凝胶微球的制备方法

权利要求书

1.一种基于双水相液滴的细胞3D培养水凝胶微球的制备方法，其特征在于：包括下列步骤：

(1)芯片泵阀的集成：利用常规软光刻的方法，制备PDMS芯片；在一个传统的“十字”流微流控液滴芯片中，集成气动阀控制系统；所述芯片主要由连续相入口(1)，气体入口(2)，分散相入口(3)，液滴出口(4)，分散相通道(5)，气体通道(6)，连续相通道(7)，主通道(8)和气动泵阀(9)组成；

连续相入口(1)、分散相入口(3)分别通过连续相通道(7)、分散相通道(5)与主通道(8)连接，分散相通道与连续相通道汇聚到主通道处形成“十字”交叉口；气体入口(2)经气体通道(6)到达气动泵阀(9)，其中的气体驱动泵阀侧壁发生弹性形变；

气动泵阀(9)的位置在“十字”交叉口上游的分散相通道(5)两侧，通过泵阀充气与静息两种状态周期性挤压分散相通道，从而使分散相间断性地进入连续相中，稳定可控地形成液滴；

(2)水凝胶材料的选择：选用生物相容性和稳定性都很好的聚乙二醇(PEG)-葡聚糖组成的双水相体系；所述PEG分子量范围：8000-20000Da、浓度范围：10-50％；葡聚糖分子量范围：70k-500kDa、浓度范围：10-30％；

为了产生水凝胶微球，在分散相中可混入水凝胶预聚体；选用可以快速交联的水凝胶材料海藻素钠，使用的粘度范围：55-1000cps、浓度范围：0.1-2％；

(3)水凝胶微球合成及细胞负载：细胞经消化后，细胞密度为10⁵-10⁸个/ml的悬液与含有海藻酸钠的分散相溶液充分混匀后，通过分散相入口(3)作为整体通入到分散相通道(5)中，经过泵阀的分离与连续相的维持作用，在主通道(8)内稳定形成含有细胞的液滴；芯片出口(4)通入浓度为0.5-4％CaCl₂溶液，快速原位交联海藻酸钠形成水凝胶微球；分散相流速0.01-1μl/min，连续相流速0.5-5μl/min，泵阀开关周期0.1-1s，通过分散相流速、连续相流速、和泵阀开关周期的调节，可以控制液滴的大小、间距和其他参数；

(4)细胞的3D培养:经过上述步骤制备的负载细胞的水凝胶微球可以经过离心收集，离心速率300-800rpm，1-3min，后直接转移到培养基中；即可在常规细胞培养条件下进行培养，培养期间每隔1-3天换液一次，保证细胞营养，期间可以进行相关生物学表征。

2.根据权利要求1所述的一种基于双水相液滴的细胞3D培养水凝胶微球的制备方法，其特征在于：所述芯片主通道(8)宽度100-300μm，长1-2cm；泵阀(9)与分散相通道(5)间距40-60μm，泵阀间的分散相通道宽40-60μm，芯片各部分通道高度均为100-300μm。

3.根据权利要求1所述的一种基于双水相液滴的细胞3D培养水凝胶微球的制备方法，其特征在于：使用的水凝胶材料是任何能快速交联的物质；具体为海藻酸钠、壳聚糖、光聚明胶、PEGDA；进行负载的细胞包括有癌细胞、干细胞、内皮细胞等。