[发明专利]一种创伤弧菌重组脂蛋白亚单位疫苗及制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种创伤弧菌及其编码基因与疫苗的应用。特别涉及一种创伤弧菌及其编码基因在用疫苗防治弧菌病方面的应用。属于生物技术基因工程领域。

背景技术

创伤弧菌，革兰氏阴性菌，γ-变形菌纲，属于弧菌属，是有积极利用乳糖表型的菌株，以此区别于其他的弧菌。它们居住在河口和海洋中，能从蛤蜊、鱼、蚌类等分离得到，也能从沉积物和浮游生物中获得。创伤弧菌作为全球重要的海洋致病细菌，与霍乱弧菌、肠炎弧菌并列为造成人类感染疾病的三大弧菌。如果人感染了创伤弧菌，就会导致败血症和肠胃炎，而患肝病的个体及免疫功能低下者一旦感染创伤弧菌，容易发生致命的伤口感染和原发性败血症，病死率超过50％。2003年起欧盟已要求对从我国进口的水产品进行创伤弧菌的检测，鱼虾产品均不得检出创伤弧菌。在养殖渔业上，弧菌属细菌引起的弧菌病(Vibriosis)是目前世界上引起鱼、虾、贝、蟹等水产养殖动物高死亡率的主要病原之一，每年都造成重大经济损失。现阶段，我国主要的应对方法是使用抗生素。然而，频繁使用抗生素会导致耐药病原体的出现、产品抗生素残留以及水环境污染等问题，对公众健康构成巨大威胁。因此，从人类健康及渔业养殖发展要求，迫切需要开发高效无环境污染的创伤弧菌疫苗，而目前创伤弧菌的高效疫苗的开发尚少，还需深入研究开发。

在疫苗研究方面，很多科学工作者对不同细菌的外膜蛋白Omp进行了大量的研究，，如嗜水气单胞菌、鳗弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、迟缓爱德华菌等，并深入探讨了其免疫原性和免疫保护性，其中一些实验结果充分的说明了外膜蛋白在抗原性和免疫保护性方面的有重要作用。

而脂蛋白作为一类结构独特的蛋白，成熟后通过N末端半胱氨酸的脂基团定位在细胞膜上发挥其功能作用。脂蛋白扮演了细菌重要生理过程中多方面的角色，包括细胞膜合成、信号转导、细菌粘附、抗生素抗性、物质转运中的关键蛋白。同时，研究表明某些脂蛋白也是重要的免疫刺激因子和候选疫苗，不仅能够触发宿主的先天性免疫系统，而且也能够引起适应性免疫应答反应，有效提高介导TLRs通路的细胞因子的产生，从而引发特异性免疫响应。

本发明通过构建一种的融合重组脂蛋白相应的表达载体，在大肠杆菌中诱导表达，收集纯化获得相应蛋白质亚单位疫苗，免疫小鼠，进行攻毒实验。实验结果证明该重组脂蛋白亚单位疫苗对创伤弧菌感染具有较高免疫保护效果，从而为后续工业化生产和大规模商业化应用提供了参考依据。

发明内容

本发明的目的是提供一种创伤弧菌亚单位疫苗及制备方法，该疫苗可用于防治致病性创伤弧菌引起的人类及养殖鱼类弧菌病。

本发明首先提供了一种创伤弧菌亚单位疫苗，所述疫苗以创伤弧菌外膜脂蛋白IlpA 和外膜蛋白OmpU的部分序列组成的融合重组蛋白IlpA32-OmpU作为抗原成分，所述融合重组蛋白IlpA32-OmpU由序列表中序列1的DNA序列或序列表中序列2蛋白质序列的多核苷酸所示。

所述融合重组亚单位疫苗蛋白IlpA32-OmpU，是具有序列表中序列2氨基酸残基序列的蛋白质；序列表中序列2的氨基酸残基序列是由347个氨基酸残基组成的蛋白质。

所述创伤弧菌亚单位疫苗的制备方法，将IlpA的N端序列(前32个氨基酸)的与 OmpU去除掉信号肽后的C端序列相连成重组融合蛋白IlpA32-OmpU，在大肠杆菌进行表达后由于具有脂蛋白IlpA的细胞内进行脂基团修饰的信号序列，融合重组蛋白在大肠杆菌内被修饰为脂蛋白。

含有本发明基因的表达载体及菌株均属于本发明的保护范围。

扩增该蛋白编码基因中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

表达的重组融合脂蛋白IlpA32-OmpU能够激活免疫系统的TLR2受体介导的信号通路，进而激活机体先天性免疫系统并分泌细胞因子，有增强免疫效果的佐剂作用。融和蛋白FLaA-OmpK具有更强的免疫原性,诱发有效抗体的作用明显强于蛋白OmpU。