[发明专利]一种乙酰氨基葡萄糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌

说明书

技术领域

本发明涉及一种乙酰氨基葡萄糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌的，属于遗传工程领域。

背景技术

乙酰氨基葡萄糖是生物体内的一种单糖，广泛存在于细菌、酵母、霉菌、植物以及动物体内。在人体中，乙酰氨基葡萄糖是糖胺聚糖二糖单元的合成前体，其对修复和维持软骨及关节组织功能具有重要作用。因此，乙酰氨基葡萄糖被广泛作为药物和营养膳食添加来治疗和修复关节损伤。此外，乙酰氨基葡萄糖在化妆品领域也具有诸多应用。目前，乙酰氨基葡萄糖主要采用酸解虾壳或蟹壳中甲壳素生产，此方法产生的废液对环境污染较为严重，而且得到的产品易引起过敏反应，不适宜海鲜过敏的人群服用。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，其产品被FDA认证为“generally regarded as safe”(GRAS)安全级别。因此，运用代谢工程手段构建重组枯草芽孢杆菌是生产食品安全级乙酰氨基葡萄糖的有效途径。然而，专利申请201510761678.6中构建的重组枯草芽孢杆菌(BSGNKAP-PxylA-glmS-P43-GNA1)存在产量不高、产物转化率较低的缺点。因此，提高乙酰氨基葡萄糖合成途径代谢通量，是提高乙酰氨基葡萄糖产量的亟待解决问题。因此，提高乙酰氨基葡萄糖合成途径代谢通量，是提高乙酰氨基葡萄糖产量亟待解决的问题。目前枯草芽孢杆菌中催化乙酰氨基葡萄糖合成途径的最后一步反应，即6-磷酸乙酰氨基葡萄糖转化为乙酰氨基葡萄糖的酶尚不清楚。据报道在酿酒酵母中表达来自于大肠杆菌的HAD-like家族的三个磷酸酶后对乙酰氨基葡萄糖的合成都有明显的促进作用；而以大肠杆菌作为宿主菌时只需强化6-磷酸氨基葡萄糖合酶glmS与6-磷酸氨基葡萄糖乙酰化酶基因GNA1便可达到很高的乙酰氨基葡萄糖产量，很可能是因为其周质空间中存在丰富的磷酸酶可以催化6-磷酸乙酰氨基葡萄糖转化为乙酰氨基葡萄糖。而枯草芽孢杆菌为革兰氏阳性菌，其不存在大肠杆菌那样的周质空间结构，因此推测在重组枯草芽孢杆菌BSGNKAP-PxylA-glmS-P43-GNA1中6-磷酸乙酰氨基葡萄糖转化为乙酰氨基葡萄糖的反应可能为其合成乙酰氨基葡萄糖的限速步骤。枯草芽孢杆菌中有一些组成型启动子其表达强度不会受到环境因素的影响，其中启动子Pveg强度较强，具体参见文献GUIZIOU S等.A part toolbox to tune genetic expression in Bacillus subtilis[J].Nucleic Acids Research,2016,44(15):gkw624。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种高效合成乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌。

本发明的第一个目的是提供一种乙酰氨基葡萄糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌，所述重组枯草芽孢杆菌整合表达了磷酸酶基因yqaB，并强化表达6-磷酸氨基葡萄糖合酶基因glmS。

在本发明的一种实施方式中，所述整合表达磷酸酶基因yqaB是以强组成型启动子P_veg控制磷酸酶基因yqaB表达，通过同源重组替换将其整合在基因组上。

在本发明的一种实施方式中，所述磷酸酶基因yqaB表达的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在本发明的一种实施方式中，强化表达6-磷酸氨基葡萄糖合酶基因glmS是将6-磷酸氨基葡萄糖合酶基因glmS的启动子P_xylA替换为强组成型启动子P_veg。

在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌是以枯草芽孢杆菌BSGNKAP-P_xylA-glmS-P₄₃-GNA1为出发菌株。

在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌BSGNKAP-P_xylA-glmS-P₄₃-GNA1是以枯草芽孢杆菌168为基础，基因型作如下改造得到的：ΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔldhΔpt aΔglcKΔpckAΔpyk::lox72，并以木糖诱导启动子P_xylA调控表达glmS、在质粒上以启动子P₄₃调控表达GNA1的重组表达。

在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌BSGNKAP，是申请号为201510761678.6的专利申请中构建的重组枯草芽孢杆菌BSGNKAP。