[发明专利]用于rLj‑RGD3免疫原性检测的ELISA试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种ELISA试剂盒，尤其是一种用于rLj-RGD3免疫原性检测的ELISA试剂盒。

背景技术

Lj-RGD3为来源于日本七鳃鳗口腔腺分泌物的RGD毒素蛋白，由117个氨基酸残基组成，Lj-RGD3的一级结构除具有三个RGD 模体和一对半胱氨酸这一典型的RGD毒素蛋白特征外，还含有17个组氨酸，17个精氨酸，是一类HRG的碱性蛋白，其序列已公开于专利号为200510083437.7、名称为“具抗肿瘤作用的日本七鳃鳗口腔腺RGD模体蛋白的基因克隆与表达”的中国发明专利文献中，即命名为Lampetrin3的蛋白，具有抗血管新生、抗肿瘤增殖、抗血栓等功效。

ELISA（酶联免疫吸附试验，酶联免疫试剂盒）是酶免疫测定技术中应用最广的技术，其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯微量反应板）表面，使酶标记的抗原抗体在固相表面进行反应，用洗涤法将液相中的游离成分洗除，通过底物显色，读取OD₄₅₀，比对标准曲线，确定所检测的抗原或抗体含量。常用的 ELISA（酶联免疫吸附试验）法有双抗体夹心法和桥接法，前者用于检测大分子抗原，后者用于测定多克隆抗体，故后者常用于免疫原性检测，即检测抗原能够刺激机体形成特异抗体的能力，一般免疫原性检测时要求抗原蛋白含量大于5.0mg，蛋白纯度高于85%。虽然市场上有大量检测不同抗原或抗体的试剂盒有售，但目前受制备rLj-RGD3的得率及纯度影响，尚没有专用于rLj-RGD3免疫原性检测的方法和试剂盒。

发明内容

本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种用于rLj-RGD3免疫原性检测的ELISA试剂盒。

本发明的技术方案是：一种用于rLj-RGD3免疫原性检测的ELISA试剂盒，有吸附在固相载体上的抗原及标准曲线板，其特征在于：

所述抗原依次按照如下步骤制备：

（1）将rLj-RGD3重组表达菌BL21培养至对数生长期；

（2）进行终浓度为1 mM的IPTG诱导，诱导温度30 ℃；

（3）10000 g 离心10 min收集菌体，弃上清，以每100 ml的菌体加4 ml 冰冷的1 X Binding buffer重悬细胞；

（4）置于冰上超声裂解细胞，直至溶液不再粘稠；

（5）14000 g 离心20 min取上清，弃沉淀；

（6）上清用0.45 µm的一次性除菌滤器过滤；

（7）His.Bind Column纯化：吸去His.Bind Column上室的贮液并打开下面管口；用10 ml的1x Binding Buffer对柱子进行平衡；上样；用10 ml的1x Binding Buffer洗柱；用10 ml的1x Wash Buffer洗柱；用5 ml的1x Elute Buffer洗脱目的蛋白；得rLj-RGD3蛋白为抗原；

所述标准曲线依次按照如下方法制备：

（1）用所得rLj-RGD3蛋白免疫两只实验兔：免疫前血清采集→每只兔采用50~200 μg rLj-RGD3与完全佐剂混合进行首次免疫→第14日采用每兔50~200 μg rLj-RGD3与不完全佐剂混合进行第二次免疫并于第21天采血进行效价测定→第35日采用每兔50~200 μg rLj-RGD3与不完全佐剂混合进行第三次免疫并于第45天采血进行效价测定→第56日以每兔50~200 μg rLj-RGD3与PBS混合进行第四次免疫→于第70日将动物进行安乐死收集血清；

（2）血清用PBS等体积稀释，5000~10000 rpm离心15分钟，取上清→用10倍体积的PBS清洗亲和柱以平衡柱子→将稀释好的上清加入平衡好的柱子中，室温下混合摇动2~4小时或4 ℃过夜→用10倍体积的PBS清洗亲和柱→用2倍体积的抗体洗脱液洗涤柱子，以得到rLj-RGD3多克隆抗体；

（3）用辣根过氧化物酶对rLj-RGD3蛋白进行标记；

（4）在酶标板上以每孔50 μl的rLj-RGD3抗原蛋白铺板，并于室温孵育1~2 h 或4 ℃过夜；

（5）室温下用封闭液封闭至少30 min；

（6）移除封闭液并洗板；