[发明专利]一种白菜CRISPR‑Cas9基因编辑体系的建立及其应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术及其应用。

背景技术

近年来，基因组编辑技术(genome engineering technologies)的快速发展为生物学研究带来了重大变化。与传统的基因克隆不同的是，基因组编辑技术可直接应用在基因组上进行DNA序列的敲除、插入、突变以及组合编辑等，从而能够将基因功能和调控元件相互联系在一起，在市场生物工程等方面具有广阔的应用前景。CRISPR/Cas9系统是由导向RNA介导的基因组定向编辑技术。Cas9核酸酶可以对靶位点进行识别和切割，形成DNA双链断裂结构，从而激活细胞内的两种修复机制，即非同源末端连接或同源重组，通过这两种修复机制引发断口处碱基的丢失、插入和替换，获得突变体。在靶标DNA区域设计包含20bp左右的oligo DNA，设计的oligo DNA的序列第一个碱基应为G，若第一个碱基不是G，可自行加上。CRISPR-Cas9系统以设计操纵简便、编辑高效与通用性广等优势成为新一代基因组编辑技术，为基因组定向改造调控与应用等带来了突破性的革命。

白菜(结球白菜和不结球白菜)，十字花科芸薹属，它原产于中国，是中国的传统蔬菜。现代的白菜一般分为大白菜和小白菜，北方人一般把大白菜叫做“白菜”，而小白菜则称作“油菜”。白菜中含有B族维生素、维生素C、钙、铁、磷，白菜中微量元素锌的含量也是非常高的。南亚、日、美及欧洲一些国家也广泛种植，现在已经成为世界性蔬菜。近年来，随着人们生活水平的提高，对白菜的品质要求也越来越高，利用CRISPR-Cas9基因编辑技术也对提高白菜的品质起到了创新性的作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种CRISPR-Cas9介导的植物基因编辑载体。

本发明的另一目的在于提供上述的CRISPR-Cas9介导的植物基因编辑载体在白菜基因功能研究或白菜基因工程育种中的应用。

本发明的又一目的在于提供一种十字花科作物CRISPR-Cas9基因编辑体系的建立方法。本发明的方法为针对十字花科作物例如白菜的高效基因组编辑方法，通过本发明的方法可以获得CRISPR-Cas9介导的白菜基因编辑体系。本发明利用载体pChimera sgRNA vector(质粒编号：CD3-1930)，pCas9-TPC(质粒编号：CD3-1927)购自www.arabidopsis.org。通过设计特异性向导RNA序列与靶序列进行碱基配对，载体携带特异性向导RNA，通过农杆菌转化至十字花科作物例如白菜的外植体，能够实现对十字花科作物基因组的编辑。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种CRISPR-Cas9介导的植物基因编辑载体，采用以下方法构建：设计两对sgRNA引物sGAvrIIF1/sGR1和sGF2/sGAvrIIR2，所述引物的序列分别为：

sGAvrIIF1：GATCCTAGGAGCTTTCGTTGAACAACGGAAACT

sGR1：GCTCTAAAAC(sgRNA反向互补序列)CAATCACTACTTCGACTCTAGCTG

sGF2：AGTAGTGATT(sgRNA正向序列)GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGT

sGAvrIIR2：GATCCTAGGGCCATTTGTCTGCAGAATTGGCGC；

所述的sgRNA正向序列为从目的基因序列NGG序列结构前面选择20bp的序列，sgRNA正向序列的第一个碱基必须是G，因此sgRNA正向序列也可以用GNNNNNNNNNNNNNNNNNNN表示(N可以为A、T、G、C)。所述的sgRNA反向互补序列与所述的sgRNA正向序列反向互补，可以用NNNNNNNNNNNNNNNNNNNC表示(N可以为A、T、G、C)。

分别以pChimera sgRNA vector为模板进行PCR扩增，分别取纯化目的片段以sGAvrIIF1/sGAvrIIR2为引物进行融合PCR；将载体pCAS9-TPC与融合PCR产物酶切后融合连接，融合连接产物转化大肠杆菌，获得阳性菌落进行培养提取质粒得到植物基因编辑载体。

含有上述植物基因编辑载体的转基因重组菌。

上述的植物基因编辑载体在十字花科作物基因编辑中的应用。

上述的转基因重组菌在十字花科作物基因编辑中的应用。

如SEQ ID NO.2所示的载体pCAS9-TPC在植物基因编辑中的应用。

一种十字花科作物CRISPR-Cas9基因编辑体系的建立方法，包括如下步骤：