[发明专利]人类EGFR基因T790M突变检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明属于基因突变检测领域，尤其涉及人类EGFR基因T790M突变检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

人类表皮生长因子受体（Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR）是一种由原癌基因C-erbB-1(HER-1)编码的具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，广泛表达于大部分正常上皮细胞中。然而在许多实体肿瘤（如非小细胞肺癌）中往往存在EGFR高表达或异常表达的情况，这与肿瘤细胞的增殖、血管生成、侵袭、转移及凋亡的抑制有关，因此EGFR已经成为相关肿瘤（尤其是非小细胞肺癌）靶向治疗的一个重要靶点。目前应用于临床的EGFR靶向药物包括:EGFR酪氨酸激酶抑制剂（TKIs，如吉非替尼即易瑞沙和厄罗替尼即特罗凯），以及EGFR单克隆抗体如西妥昔单抗。大量研究表明，吉非替尼（Gefitinib）和厄罗替尼（Erlotinib）的疗效与EGFR基因尤其是其18-21号外显子的突变状况密切相关。携带EGFR基因突变的肺癌患者对酪氨酸激酶抑制剂高度敏感，患者将得到很大的受益；反之野生型基因的患者将基本不受益，因此EGFR基因检测作为非小细胞肺癌等癌症靶向药物选用的前提被列入了最新的NCCN（美国国家综合癌症网络）肿瘤临床实践指南。

从2期临床试验阶段开始，EGFR酪氨酸激酶抑制剂在女性、非吸烟者、腺癌、东方人中表现出较好的临床效果。而研究表明，EGFR基因突变在这类肺癌患者中发生的频率较高。已有共计 2880 例病例表明，EGFR基因突变的频率与东方人（32%）、女性（38%）、非吸烟者（47%）、腺癌（30%）等临床背景密切相关。EGFR基因的体细胞突变与NSCLC患者对吉非替尼的敏感性相关。这些突变均发生在酪氨酸激酶域的ATP结合域附近，88%表现为19号外显子的非移码缺失突变和21号外显子的单碱基替代突变。其中初始发生第20外显子790位密码子的突变即T790M，则表明TKI药物不适用。此外，临床上对于TKI药物有效的患者，在用药后期均会产生耐药性，超过50%的患者发生了T790M突变。因此在临床用药选择时，T790M耐药突变的检测对于TKI的用药指导十分重要。

发明内容

本发明提供了一种基于耐热DNA聚合酶、耐热DNA连接酶和限制性内切酶的人类EGFR基因T790M突变检测方法及试剂盒。针对T790M突变，可以实现高效检测，且十分简便经济。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：

人类EGFR基因T790M突变检测试剂盒，组分如表1-2所示：

表1 本发明扩增试剂盒组分

表2 序列表

其中，表1中SEQ ID NO.3的5’端的第一个核苷酸为磷酸化修饰，SEQ ID NO.4的5’端和3’端的第一个核苷酸均为磷酸化修饰，各扩增引物和连接引物的浓度均为10μmol/L。

利用所述试剂盒的人类EGFR基因T790M突变检测方法，主要步骤包括如下：

（1）EGFR基因第20号外显子特定片段扩增

提取待测样本基因组DNA，以其为模板并采用本发明试剂盒（表1所示）配制扩增体系，扩增条件为：95℃预变性5min；94℃变性15s，50-54℃退火60-90s，72℃延伸60-90s，循环30-36次；72℃终延伸10min。

（2）目的基因片段的酶切和电泳分析

采用试剂盒中的限制性内切酶BstUI对PCR扩增产物在60℃下酶切1h。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，若出现200bp和400bp的两条条带，则表明样品有EGFR基因的T790M突变，若只有单条400bp的条带，则表明样品未发明EGFR基因的T790M突变。

本发明的有益效果是，基于耐热DNA聚合酶、耐热DNA连接酶和针对EGFR基因的T790M突变的特异连接引物，极大抑制了样品中的野生型EGFR基因的扩增，使得T790M突变片段的比例高于50%，从而保证了限制性内切酶对于杂合基因片段体系的准确识别。本发明方法及试剂盒可以有效检测低至1%的EGFR基因T790M突变，准确率极高，操作简便且检测费用低廉。

附图说明

图1是采用本发明方法对2例非小细胞肺癌患者组织样品中EGFR基因第20号外显子扩增片段的电泳检测图谱。电泳条件为：上样量为5μl，1.5%琼脂糖凝胶，120V电泳45min。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明并不限于此。

实施例1