[发明专利]采用敲除技术建立Gadd45a敲除兔模型的方法

权利要求书

1.一种采用敲除技术建立Gadd45a敲除兔模型的方法，其特征在于：

①构建sgRNA：

在Gadd45a基因第1个外显子处选取2个sgRNA序列作用靶点，合成两对寡聚核苷酸链：

Sgrna1-F TAGGTCGCGGTCCTCGGCGAAACC

Sgrna1-RAAACGGTTTCGCCGAGGACCGCGA;

Sgrna2-F TAGGACTCTCCGCAATCCGGGTGC

Sgrna2-R AAACGCACCCGGATTGCGGAGAGT；

②合成双链DNA：

两条合成的寡聚核苷酸链经退火形成双链DNA；反应条件：95℃ 5min后室温放置1h；双链DNA反应体系

；

③p UC-57载体线性化：

p UC-57载体在与②中合成的DNA连接时，需要先经Bbs I线性化，并回收纯化；

酶切反应体系表

；

④连接p UC-57载体和双链DNA：

按如下连接体系进行混样，简短离心，放入16℃连接仪连接过夜，

连接反应体系表

；

⑤转化：

（1）从-80℃冰箱取50 μL感受态细菌，加入10 μL④中的连接产物，混匀，在冰上冷却30分钟；

（2）42℃水浴热激90s，冰上冷却2分钟；

（3）加200μL LB液体培养基，在恒温震荡培养箱37℃，250 rpm震荡培养30 min；

（4）吸取200 μL菌液均匀地涂布在氨苄抗性LB平板上，放于37℃恒温培养箱中培养12小时；

⑥单克隆的挑取及质粒DNA的提取：

从培养基中挑取单菌落，接种于6 mL液体LB培养基中，培养基中含6 μL氨苄青霉素，放于摇床中，37℃培养12-14h；将细菌中的质粒提取出来；

⑦鉴定质粒测序

使用M13通用引物对质粒进行测序分析，测序连接正确后可用于后续实验；

⑧CAS9表达质粒，经酶切线性化，用于体外转录；CAS9mRNA的合成在体外利用T7RNA聚合酶完成，酶切37℃ 3h，电泳跑胶后，使用普通DNA琼脂糖胶回收试剂盒进行回收；

酶切体系

。

2.权利要求1所述采用敲除技术建立Gadd45a敲除兔模型的方法，其特征在于：p UC57-sgRNA载体序列为SEQIDNo.1

权利要求1所述采用敲除技术建立Gadd45a敲除兔模型的方法，其特征在于：模型建立过程：

（1）受精卵的获取和显微注射

注射卵泡刺激素，之后注射人绒毛膜促性腺激素，获取受精卵，通过显微注射仪器将预混合好的CAS9mRNA/sgRNA混合物注射到细胞质中，其中CAS9mRNA 150ng/μl； sgRNA 30ng/μl；

（2）体外培养受精卵并进行发育

将显微注射的受精卵转移到培养液中，置于37℃恒温培养箱中培养，发育到桑椹胚时期时，用吸卵针将单个胚胎转移到离心管中，用于后面实验；

（3）胚胎Gadd45a基因敲除情况鉴定

显微注射后的胚胎，体外培养5d后，取出发育至桑椹胚期的胚胎，放于PBS中清洗3次后，收集单个胚胎至于PCR管中，在单个胚胎中加入5μL NP40裂解液进行胚胎裂解，裂解条件为：56℃，1 h；95℃，10 min，以裂解产物为模板，使用PCR上游和下游引物进行PCR扩增，电泳鉴定，并进行DNA测序，得到基因型鉴定结果；

设计PCR引物如下：

上游引物：GGGTTCGGATTGCCCAAA (Sense)

下游引物：GGTGCCCTGTGCAAACT (AntiSense)

PCR反应体系

；

PCR反应条件：

95℃预变性5min；94 ℃变性30s，58℃退火30 s，72 ℃延伸40s；35个循环；72 ℃延伸5min；

（4）注射后的受精卵移植及动物培育

显微注射后，将受精卵移植，进行胚胎发育，进行规范化饲养。