[发明专利]Cr(VI)还原菌的鉴定及其培养方法

权利要求书

1.Cr(VI)还原菌的鉴定及其培养方法，其特征在于：其步骤是：

(1)培养基的制备

细菌培养基(LB)：称取蛋白胨10g，牛肉膏5g，NaCl 5g，葡萄糖5g，少量乳酸钠，加入1000mL蒸馏水中，用NaOH和HCl调节pH至7.9左右，于115℃灭菌30min，冷却后备用(固体培养基加入20g/L琼脂)。

含Cr(VI)培养基：实验中以重铬酸钾(K₂Cr₂O₇)作为Cr(VI)源，在已灭菌的细菌培养基中加入相应浓度的重铬酸钾(将重铬酸钾溶液跟液体培养基分别灭菌，冷却后在超净工作台中将两溶液混合在一起)，调至所需浓度。

(2)菌株分离

铬还原菌从铬污染土壤中分离。称取10g土壤样品于已灭菌的250mL锥形瓶中，加入50mL灭菌培养基，置于恒温摇床中，30℃、150r·min^-1摇床培养24h，在LB液体培养基中逐步提高含Cr(VI)浓度，增加Cr(VI)还原菌的耐受性，用10倍稀释法将其稀释后涂布在固体培养基上进行菌株的分离筛选和培养。

(3)菌株筛选

通过测定菌株在不同Cr(VI)浓度下的OD₆₀₀对每一株分离菌株评估它的最低抑菌浓度来测定它的耐Cr(VI)能力，抑制细菌生长的最低浓度被认为是MIC(Minimum inhibitoryconcentration)。从样品中分离得到8株菌株能耐受150mg/L、200mg/L Cr(VI)，并且培养液中Cr(VI)去除率可以达到50％以上。

(4)菌株鉴定

将菌株划线接种于固体培养基，培养2-3d，通过革兰氏染色法在显微镜下观察菌落形态，并进行生理生化检测。

将菌株液体培养24h，离心收集菌体，利用细菌基因组DNA提取试剂盒抽提基因组总DNA。使用16S rDNA通用引物27F：

5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1492R：

5’-GGTTACCTTGTTACGACGACTT-3’，直接扩增菌体的16S rDNA片段。PCR扩增产物序列送由北京六合华大基因科技有限公司进行测序。

2.根据权利要求1所述的Cr(VI)还原菌的鉴定及其培养方法，其特征在于：其培养条件为pH7-9、接种量6％(体积分数)及30℃条件下，50mg/L的Cr(VI)在处理72h后，去除率可达89.4％。

3.根据权利要求1所述的Cr(VI)还原菌的鉴定及其培养方法，所筛选的ZJ-8菌株的16SrDNA序列具有最大同源性的菌株是Ochrobactrum tritici strain，同源性达99％。