[发明专利]副猪嗜血杆菌病4型、5型二价灭活疫苗效力的检验方法

权利要求书

1.副猪嗜血杆菌病4型、5型二价灭活疫苗效力的检验方法，其特征在于包括以下步骤：

1)分别制备副猪嗜血杆菌4型单价灭活疫苗和副猪嗜血杆菌5型单价灭活疫苗，依据《中国兽药典》质量标准检验疫苗，合格品分别作为4型疫苗参照品和5型疫苗参照品；

2)取待测的4型、5型二价灭活疫苗，以及步骤1)所得的4型疫苗参照品和5型疫苗参照品，采用相同方法分别免疫豚鼠，而后采血，通过间接ELISA方法分别检测抗体滴度，比较待测的4型、5型二价灭活疫苗所免疫的血清抗体滴度与4型疫苗参照品、5型疫苗参照品所免疫的血清抗体滴度之间的数值关系。

2.根据权利要求1所述的副猪嗜血杆菌病4型、5型二价灭活疫苗效力的检验方法，其特征在于步骤2)所述的相同方法为：先对豚鼠进行首次免疫，2周后再次免疫接种1次，二免后2周，免疫结束。

3.根据权利要求1所述的副猪嗜血杆菌病4型、5型二价灭活疫苗效力的检验方法，其特征在于所述通过间接ELISA方法分别检测抗体滴度，包括以下操作：

A)将副猪嗜血杆菌抗原用包被液进行稀释，加至96孔板中，100μL/孔；

B)室温孵育30min，用PBS清洗96孔板3遍；

C)加入封闭液，100μL/孔；对照组血清、免疫组血清和标准血清分别加入至第一列，倍比稀释至第10列，第11和12列分别加入16倍稀释的标准阴性血清和标准阳性血清；

D)室温孵育1h，洗96孔板3次；

E)以100μL/孔的量向其中加入以封闭液进行了1:2000(v:v)倍稀释的HRP标记的抗豚鼠IgG，37℃孵育1小时；

F)洗液洗96孔板3次；

G)加入100μL/孔OPD底液，室温孵育15min；

H)50μL/孔终止液终止反应；

I)492nm条件下测定OD值。

4.根据权利要求3所述的副猪嗜血杆菌病4型、5型二价灭活疫苗效力的检验方法，其特征在于所述比较待测的4型、5型二价灭活疫苗所免疫的血清抗体滴度与4型疫苗参照品、5型疫苗参照品所免疫的血清抗体滴度之间的数值关系，是分别计算待测的4型、5型二价灭活疫苗所免疫血清中4型抗体滴度与4型疫苗参照品所免疫血清中抗体滴度之间比值，以及待测的4型、5型二价灭活疫苗所免疫血清中5型抗体滴度与5型疫苗参照品所免疫血清中抗体滴度之间比值；上述两个比值均大于或等于1时，检验结果为合格，否则检验结果为不合格。

5.根据权利要求4所述的副猪嗜血杆菌病4型、5型二价灭活疫苗效力的检验方法，其特征在于所述比较待测的4型、5型二价灭活疫苗所免疫的血清抗体滴度与4型疫苗参照品、5型疫苗参照品所免疫的血清抗体滴度之间的数值关系，是利用版本号为4.0的Rel Pot软件实现的，在此过程中，满足以下条件：标准阴性血清OD值小于0.1，标准阴性血清OD值与标准阳性血清OD值大于0.5；版本号为4.0的Rel Pot软件中斜率大于0.8。

6.根据权利要求1所述的副猪嗜血杆菌病4型、5型二价灭活疫苗效力的检验方法，其特征在于步骤1)中，副猪嗜血杆菌4型单价灭活疫苗或副猪嗜血杆菌5型单价灭活疫苗是通过以下方法制备的：

α)培养副猪嗜血杆菌单血清型菌株，制备得到活菌液；

β)利用甲醛将步骤α)制备的活菌液进行灭活；

γ)采用离心而PBS溶液后重悬的方式将步骤β)灭活后菌液中菌体浓度调整至10⁹～10¹⁰CFU/mL，即得到抗原溶液；

δ)将步骤γ)所得抗原溶液与佐剂混合，即得到副猪嗜血杆菌单血清型灭活疫苗。