[发明专利]一种制备重组人α‑L‑艾杜糖醛酸酶的方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及人α-L-艾杜糖醛酸酶基因重组载体，用该载体转化的宿主重组表达人α-L-艾杜糖醛酸酶的方法及应用。

背景技术

粘多糖贮积症(Mucopolysaccharidosis，MPS)由酸性粘多糖降解酶缺乏，致糖胺聚糖降解代谢障碍引起，根据不同酶缺陷(大约10余种)，临床上又分为8型，其中MPS-Ⅰ是我国发病率相对较高的类型。溶酶体α-L-艾杜糖醛酸酶(α-L-iduronidase,IDUA)缺陷致糖胺聚糖(glycosaminoglycans，GAGs)降解代谢障碍引发MPS-Ⅰ，多在婴儿或儿童期发生，是一种致残、致死性遗传性代谢疾病。重组人α-L-艾杜糖醛酸酶(recombinantα-L-iduronidase,rhIDUA)作为酶替代治疗(ERT)药物在临床治疗显示患者均能安全度过童年期，且伴随明显的认知功能恢复和某些症状的改善。

除ERT治疗手段外，造血干细胞治疗也是十分有效的手段。ERT以及造血干细胞治疗目前在中国仍属于空白领域，虽然，中国专利(CN201180051220.1)公开了一种反义寡核苷酸，用于调节IDUA表达来达到治疗MPS-Ⅰ型粘多糖贮积症的目的，另有中国专利(201380041239.7)公开了一种IDUA与血管肽素-2的重组融合蛋白，通过连接血管素肽靶向血脑屏障，有效改善中枢溶酶体中的葡糖氨基葡聚糖(粘多糖)的贮积。重组IDUA在欧美上市并用于MPS-Ⅰ治疗已超过十年，但我国该领域的治疗至今仍是空白。尽管重组IDUA尚不能透过血脑屏障，但其改善MPS-Ⅰ患者肺功能，尤其改善肝、脾肿大的疗效十分显著，在治疗MPS-Ⅰ并延长患者生命周期仍具有十分重要的意义。

目前虽然国外大型医疗企业有生产重组人α-L-艾杜糖醛酸酶的治疗试剂，但是该试剂价格较高，对于临床患者的治疗用药较为不利。由于治疗药物的缺失，使得国内对于该领域的治疗研究缺失严重，不利于基因治疗技术的发展，特别是对于MPS-Ⅰ型婴幼儿的治疗技术发展缓慢。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中缺少关于重组表达人α-L-艾杜糖醛酸酶(rhIDUA)研究的不足，提供一种重组表达人IDUA的方法，其包含编码IDUA的核苷酸序列、表达载体以及宿主细胞DG44细胞。

同时，本发明也公开了重组IDUA的生物活性以及用于MPS-Ⅰ型粘多糖贮积症治疗的用途。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

一种人α-L-艾杜糖醛酸酶(rhIDUA)表达载体，它是pCMV-IDUA表达质粒。

一种pCMV-IDUA表达质粒构建方法，用BglII和PacI对pCMV质粒进行双酶切后回收大片段，再用BglII和PacI对pUC-IDUA质粒进行双酶切回收目的基因片段，酶切后将产生相同黏性末端的载体片段与目的基因进行连接。

通过双酶切回收获取目的基因片段，然后进行目的基因转化结合，其中rhIDUA的碱基序列如SEQ ID NO:1所示，通过如此方式获得表达质粒载体，实现制备所需要的表达载体，它是表达质粒，性质稳定，转化效率高。

一种制备人α-L-艾杜糖醛酸酶(rhIDUA)的方法，包括用上述pCMV-IDUA表达质粒转化宿主细胞，培养转化体，获得人α-L-艾杜糖醛酸酶(rhIDUA)。

进一步，所述宿主细胞是中国仓鼠卵巢DG44(CHO DG44)细胞、人胚胎肾细胞HEK293细胞。优选中国仓鼠卵巢DG44悬浮细胞系，具有更好的表达稳定性和表达水平。

重组人α-L-艾杜糖醛酸酶(rhIDUA)，将所述表达载体转化宿主细胞，培养转化体，从培养物获得重组人α-L-艾杜糖醛酸酶(rhIDUA)。

进一步，将重组质粒pCMV-IDUA经电转法转染至CHO DG44细胞中，得到转化体。

优选地，将电转后细胞混合液转移至含SFM4培养基的6孔板中，置于37℃孵箱中培养，48h后加入10nM MTX进行加压筛选，待细胞活率恢复至90％以上，MTX增加至100nM；细胞加入MTX至500nM，待活率恢复至90％以上后，将细胞转入摇瓶培养，在培养第3天和第5天分别补加4g/L葡萄糖，继续培养至第7天。取培养液在4℃条件下，以5000rpm离心15min，收集上清经0.45μm滤膜过滤后进行纯化，得到重组人α-L-艾杜糖醛酸酶。

进一步，将所得rhIDUA的纯化采用离子交换层析纯化。优选地，采用阴离子交换层析或阳离子交换层析。