[发明专利]一种含有pMG36e‑pgsA‑gp85重组质粒的基因工程菌

说明书

技术领域

本发明涉及生物学领域，具体提供了一种含有pMG36e-pgsA-gp85重组质粒的基因工程菌。

背景技术

J亚群禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus subgroup J,ALV-J)是1988年首次从肉用型鸡中分离得到，主要引发鸡的髓细胞组织增生和肾瘤。该病已经迅速蔓延到许多国家，给世界养禽业造成巨大的损失。

目前还没有商品化的疫苗用于防治ALV-J感染，国外主要通过净化种鸡群的办法来防控ALV-J。但是由于养殖的大环境已经污染，所以只依靠净化来完全控制ALV-J感染是不可能的。最近几年，许多专家学者也都尝试研制ALV-J灭活苗和弱毒苗，但是由于灭活病毒的同时也破坏了其诱导产生抗体的能力，而且该病毒的抗原结构复杂，要想得到理想的弱毒苗十分困难。因此，研制新型有效的ALV-J疫苗势在必行。

从抵抗微生物病原感染的角度看，研制黏膜疫苗已成为热点方向。保护机体免于病原体侵犯的第一道屏障是黏膜系统，80％以上的细菌、病毒和寄生虫感染动物机体都起始于黏膜表面。机体的黏膜系统是由泌尿生殖系统、呼吸系统和消化系统组成的，另还包括眼结膜、内耳膜、外分泌腺等，所以对抗外来物入侵就只需要刺激引起黏膜免疫一个点即可刺激全身的黏膜免疫系统来完成。黏膜免疫应答可诱导保护性抗体的产生如IgM、sIgA和IgG等，也可诱导黏膜细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T Lymphocytes,CTL)发生反应，分泌产生CD4+T细胞和IFN-γ，机体预防和清除外来病原体入侵的防御能力被大大加强(Holmgren et.al.,2005)；因此说明，刺激黏膜免疫应答可相继刺激整个机体系统发生免疫应答反应，从而全身的机体被动员来对抗外来病原微生物的入侵和伤害。

具有益生特性的植物乳杆菌也是良好的外源蛋白运输载体系统，通过该菌表达的口服药用蛋白可在一定程度上有效地发挥防治疾病的作用。口服重组植物乳杆菌引起的黏膜免疫应答不仅仅局限于肠道固有层，受该菌及其相关抗原刺激的淋巴细胞从消化道Peyer氏结感应位点向鼻相关淋巴组织反应位点迁移，从而使口服该重组菌的机体对非消化道病原产生免疫保护效应。正是由于黏膜免疫系统的相通性，重组植物乳杆菌才有机会介导全身黏膜免疫保护作用。

Sorving等将构建好的Psip质粒导入植物乳杆菌内，成功地进行了外源蛋白的表达。Shi等将构建好的Psip409质粒导入植物乳杆菌内，成功地表达出H9N2病毒的血凝素基因，该重组菌口服免疫小鼠后发现其特异性抗H9N2病毒的sIgA、IgG、HI抗体效价都显著性上升并发生CD8+T细胞的免疫应答。郭红敏等将构建好的Psip-409-Ompc-DC导入植物乳杆菌内，成功地表达出Ompc-DC蛋白，该重组菌口服免疫雏鸡后对鸡白痢产生良好的免疫效果。除此，重组植物乳杆菌也成功地进行了多种酶的表达。

另外，从植物乳杆菌作为一种肠道优势菌群的角度而言，该菌株可通过其分泌的乳酸、细菌素等物质对其他菌产生作用，从而调整或维持菌群内部关系来形成稳固的生物学屏障，从而保证肠道微生态平衡。从机体感染肠道致病菌时，植物乳杆菌通过对病原菌必需生长物质的掠夺及黏附作用的排斥来抑制其侵入和定植。此外，相关研究还表明植物乳杆菌在医疗保健方面(消化道疾病、过敏性疾病和心脑血管疾病等)也发挥着重要的防治作用。

口服植物乳杆菌疫苗为常规疫苗发展开辟了一条新颖的并极具可行性的途径，为未来疫病的防治提供宝贵的思路。

pMG36e来源于pWV01载体，是经过人工改造的pWV01衍生载体，质粒大小约为3.6kb，便于为宿主所携带转运，能够把外源蛋白在多种细菌中进行表达；目前已成功在乳杆菌属、乳球菌属和链球菌属中进行其他外源蛋白基因的表达。它是由以乳酸乳球菌乳脂亚种蛋白酶基因的转录和翻译信号为基础构建而成。质粒pMG36e是由下述的主要六个部分构成：强启动子p32、多克隆位点、pWV01复制子、下游的部分开放阅读框、来自于乳酸乳菌乳脂亚种的蛋白酶基因的转录终止子和来自于质粒pE194的红毒素抗性基因Emr。