[发明专利]一种pMG36e‑pgsA‑gp85重组质粒的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物学领域，具体提供了一种pMG36e-pgsA-gp85重组质粒的构建方法。

背景技术

J亚群禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus subgroup J,ALV-J)是1988年首次从肉用型鸡中分离得到，主要引发鸡的髓细胞组织增生和肾瘤。该病已经迅速蔓延到许多国家，给世界养禽业造成巨大的损失。

目前还没有商品化的疫苗用于防治ALV-J感染，国外主要通过净化种鸡群的办法来防控ALV-J。但是由于养殖的大环境已经污染，所以只依靠净化来完全控制ALV-J感染是不可能的。最近几年，许多专家学者也都尝试研制ALV-J灭活苗和弱毒苗，但是由于灭活病毒的同时也破坏了其诱导产生抗体的能力，而且该病毒的抗原结构复杂，要想得到理想的弱毒苗十分困难。因此，研制新型有效的ALV-J疫苗势在必行。

因为黏膜侵入是病毒和细菌入侵机体的主要方式，所以利用益生菌将抗原呈递到机体黏膜组织，诱导机体发生黏膜免疫应答，从而产生特异性抗体来抵抗大量的细菌和病毒的入侵是十分有效的。植物乳杆菌作为口服疫苗已成为近年来的研制热点，其作为活载体菌株对外源保护性抗原基因进行表达，将外源目的基因的免疫原性与植物乳杆菌的益生功能相结合，符合新型疫苗的廉价、方便、安全等特点。而将外源目的基因的免疫原性与植物乳杆菌的益生功能相结合的难点是选用合适的表达载体插入外源目的基因与锚定蛋白基因，保证外源目的基因能有效地在植物乳杆菌表面表达。

pMG36e来源于pWV01载体，是经过人工改造的pWV01衍生载体，质粒大小约为3.6kb，便于为宿主所携带转运，能够把外源蛋白在多种细菌中进行表达；目前已成功在乳杆菌属、乳球菌属和链球菌属中进行其他外源蛋白基因的表达。它是由以乳酸乳球菌乳脂亚种蛋白酶基因的转录和翻译信号为基础构建而成。质粒pMG36e是由下述的主要六个部分构成：强启动子p32、多克隆位点、pWV01复制子、下游的部分开放阅读框、来自于乳酸乳菌乳脂亚种的蛋白酶基因的转录终止子和来自于质粒pE194的红毒素抗性基因Emr。

1993年，Roy等将大肠杆菌MnSOD克隆到表达载体pMG36e中，并分别电转化到携带SOD的乳酸乳球菌中和缺乏SOD的加氏乳杆菌中。1996年，Franke等借助于pMG36e表达了lcnD基因，与β-半乳糖苷酶融合的细菌素转运和成熟密切相关，为乳球菌素的运输机制的深入研究提供了基础。2000年，Xing等还利用pMG36e克隆表达了人类谷胱甘肽基因hGSTA1；2007年，张安勇等成功利用pMG36e构建成pMG36e-P30重组载体，并电转到乳酸乳球菌，免疫小鼠，结果证实该重组口服疫苗能诱发小鼠特异性体液免疫，促进发生细胞免疫应答。目前，已用pMG36e质粒来进行多种外源目的基因的表达，丰富了有关乳酸菌基因工程及分子生物学的研究的理论依据，其应用涉及多个重要领域(如食品、保健、医药等)，同时也作为重要的分子克隆工具为其他相关学科的深入研究打下了基础。

研究发现ALV-J基因组主要含有3个基因：gag、pol和env。病毒的env基因编码病毒的包膜，其亚群特异性是由env-gp85基因编码的表面囊膜蛋白所决定。其中gp85负责识别靶细胞膜上的特异性病毒受体，属于病毒的外膜蛋白，是病毒表面的球状结构，它决定了ALSV的亚群特异性，并带有病毒受体决定簇，在侵染易感细胞时起到粘附作用，并可以诱导机体产生特异性的抗体；我国近年来不断地对ALV-J的env的gp85蛋白加以研究，2013年，Dou等人表达ALV-J重组gp85囊膜蛋白，利用CpG佐剂和弗氏佐剂与重组蛋白结合免疫鸡群，检测鸡只体内的母源抗体水平，产生较好的免疫效果；2014年，Zhang等人报道，将ALV-J重组gp85囊膜糖蛋白利用脂质体进行包被后进行免疫，检测鸡体抗体水平，产生较好的免疫效果；2016年Cheng等利用二氧化硅纳米颗粒作为疫苗佐剂与ALV-J重组gp85囊膜糖蛋白结合免疫鸡群，取得了一定的效果。上述相关工作都为后续研制ALV-J亚单位疫苗提供了丰富的理论依据。