[发明专利]一种切割效率增强的HRV 3C蛋白酶底物突变体及其应用

说明书

本发明利用酵母内质网滞留筛选系统(YESS)快速解析蛋白酶底物切割位点特异性，最终提供了一种切割效率增强的HRV 3C蛋白酶底物序列突变体及其应用。该底物变体包含序列表中SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，其在蛋白纯化过程中移除纯化标签中具有较好的实际应用优势，从而有利于HRV 3C蛋白酶的进一步应用和研究。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体而言，涉及一种切割效率增强的HRV 3C蛋白酶底物序列突变体及其应用。

背景技术

人鼻病毒(HRV)是单股正链小RNA病毒，其编码的3C蛋白酶属于半胱氨酸蛋白酶家族，可以识别多肽序列LEVLFQ↓GP，并在Gln和Gly之间进行切割。HRV 3C蛋白酶具有特异性强，酶活高等特性，即使在4℃低温条件下依然有较高的酶活。目前，HRV 3C蛋白酶已广泛商品化，特别是用来在蛋白纯化过程中移除纯化标签。然而，作为一种高价值的商业酶，HRV3C蛋白酶的底物特异性还没有相关报道。

另外，蛋白酶底物切割位点特异性的研究是全面了解和应用蛋白酶的一个必要的过程，而传统的研究方法是定点突变后，表达、纯化得到相应底物突变体，然后进行体外反应，检测、定量分析。该方法工作量大，操作复杂，效率低，操作误差大，不利于实验的高效开展，因此很难筛选得到切割效率增强的HRV 3C蛋白酶底物序列突变体。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明开发了一种利用酵母内质网滞留筛选系统(YESS)来快速解析蛋白酶底物切割位点特异性的新方法--YESS-PSSC。

酵母内质网滞留信号肽(ERS,ER sequestration signal)是存在于蛋白羧基端的一段6个氨基酸长度的多肽(FEHDEL)，它可以与内质网内膜上的蛋白相互作用，使携带滞留信号肽的蛋白往返穿梭于内质网与高尔基体中以延长蛋白在内质网与高尔基体中的滞留时间，增加酶动力学范围。Aga2为酿酒酵母表面的α凝集素成分，外源蛋白可借助与Aga2的融合表达而在酵母细胞表面被展示；所使用的荧光标签分别是FLAG和HA，对应的氨基酸序列分别是DYKDDDDK和YPYDVPDYA，当各自对应的荧光抗体Anti-FLAG-APC和Anti-HA-FITC与之相结合时，根据底物的不同切割情况，可通过流式细胞仪检测到相应的荧光信号。

在带内质网滞留信号肽和不带内质网滞留信号肽两种情况下，都得到HRV 3C-P底物P1、P1’、P2’3个位点各3种突变体底物。其中，特异性最高的P1位点包括氨基酸为Q、N、F的3种底物，特异性较高的P1’位点包括氨基酸为G、A、D的3种底物，特异性较低的P2’位点包括氨基酸为P、F、W的3种底物,然后让酶和底物复合体在内质网中发生反应，不同切割情况的底物会展示在细胞表面。当发明人用对应的荧光抗体Anti-FLAG-APC和Anti-HA-FITC孵育细胞时，不被切割的底物复合体可以同时被两种荧光抗体Anti-FLAG-APC和Anti-HA-FITC标记；而被切割的底物复合体只能被荧光抗体Anti-FLAG-APC标记。所以，根据细胞表面展示底物的不同切割情况，流式细胞仪可以检测到不同的信号，取一定量的细胞分析即可得到该底物突变体的切割效率。即说明可以利用酵母内质网滞留筛选系统(YESS)来解析蛋白酶底物切割位点特异性。结果表明：对于特异性高的P1和P1’位点底物突变体，展示时，酶和底物端都需要加内质网滞留信号肽(FEHDEL)；对于特异性低的P2’位点底物突变体展示时，酶和底物端都不需要加内质网滞留信号肽；则可以通过酵母内质网滞留信号肽的不同应用来解析HRV 3C蛋白酶针对其底物切割位点P1(Q),P1’(G),P2’(P)的特异性(参见图2)。

因此，本发明利用酵母内质网滞留筛选系统(YESS)快速解析蛋白酶底物切割位点特异性，最终提供了一种切割效率增强的HRV 3C蛋白酶底物序列突变体及其应用，具体的技术方案概况如下：